19世紀50年代，在瘧疾流行區域，Burkitt發(fā)現少數非洲兒童患有一種B細胞淋巴瘤（后被命名為Burkitt淋巴瘤）；此后，在1964年，Epstein、Achong和Barr在培養的Burkitt淋巴瘤細胞中觀(guān)察到一種皰疹病毒[1]，即EB病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）。隨后，在多種疾病和腫瘤中均檢測到EB病毒，如鼻咽癌、胃癌、Hodgkin's淋巴瘤、傳染性單核細胞增多癥和獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）患者的口腔毛狀白斑癥等[2，3]。世界衛生組織將EB病毒歸為第一類(lèi)致瘤病毒，全球每年新增約200,000與EB病毒直接相關(guān)的腫瘤病例，其中在新增的8200例Burkitt腫瘤、930,000例胃癌、62,000例Hodgkin腫瘤和80,000例鼻咽癌中，與EB病毒相關(guān)的病例數目依次為6700、84,000、28,000和78,000[4，5]。EB病毒在人群中感染非常普遍，全世界95%左右的成年人被EB病毒感染[6]，大部分EB病毒感染發(fā)生在嬰幼兒時(shí)期；但并不引起癥狀或只產(chǎn)生非特征性的癥狀，而是建立終生潛伏感染狀態(tài)[2，7]。EB病毒作為一種致病病毒，由于其感染的廣泛性和普遍性，全球相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)家們一直致力于EB病毒疫苗的研發(fā)，以預防和治療EB病毒感染所引起的各種疾病和腫瘤，通過(guò)將病毒蛋白以不同形式組合形成重組蛋白，極大限度地阻斷EB病毒感染和殺傷感染細胞，是EB病毒疫苗研究的發(fā)展方向，同時(shí)結合生物材料、納米材料組裝功能疫苗，也為EB病毒疫苗的研究注入新的活力；而EB病毒的感染具有強烈地種屬特異性，只感染人類(lèi)，導致缺乏有效地動(dòng)物模型用于臨床前評估疫苗預防和治療效果，這也是目前EB病毒疫苗研究的難點(diǎn)。本文通過(guò)綜述以EB病毒糖蛋白gp350為基礎的多種預防性疫苗的臨床試驗結果和以病毒核抗原EBNAs、膜蛋白LMPs為免疫治療靶點(diǎn)疫苗的治療效果，以及相應動(dòng)物模型的構建和基礎研究方面的成果，為研發(fā)新型的EB病毒疫苗提供潛在的解決方案。

 

EB病毒是一種含172kb基因組的人類(lèi)γ皰疹病毒，其主要經(jīng)體液接觸途徑進(jìn)入人體；然后通過(guò)病毒包膜糖蛋白gp350與B淋巴細胞表面的CD21結合、以及糖蛋白gp42與人白細胞抗原結合而感染B淋巴細胞[2，8]，EB病毒還能感染其它細胞，如上皮細胞，在某些情況下還能感染T淋巴細胞、自然殺傷細胞、平滑肌細胞和單核細胞等[9]。EB病毒感染人體后，刺激免疫系統，產(chǎn)生大量細胞因子，首先產(chǎn)生γ-干擾素協(xié)同NK細胞抑制病毒感染的B淋巴細胞的復制，隨后通過(guò)特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）殺傷被感染細胞。目前認為T(mén)細胞免疫應答對控制EB病毒感染起決定性作用，也為設計疫苗刺激機體CTL應答來(lái)治療EB病毒相關(guān)疾病提供了依據。

 

EB病毒感染早期一般無(wú)癥狀或產(chǎn)生非特征性癥狀，但感染青少年或年輕人后，可能導致單核細胞增多癥；大概1%的EB病毒感染者會(huì )出現并發(fā)癥，如腦炎、肝炎、溶血性貧血或血小板減小癥。EB病毒與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并具有地域性地特點(diǎn)，如鼻咽癌主要發(fā)生在我國南方地區，50歲以上人群鼻咽癌發(fā)病率高達50/100,000；EB病毒相關(guān)的Burkitt淋巴瘤主要發(fā)生在位于赤道的非洲國家和新幾內亞[4，5]。

 

EB病毒侵染細胞后，在復制感染過(guò)程中共表達9種蛋白，其中包括6種病毒核抗原（EBNA1,EBNA2,EBNA3a,EBNA3b,EBNA3c和EBNA-LP）以及三種潛伏膜蛋白（LMP1,LMP2A,LMP2B）；還有兩種EBV編碼的核糖核酸（EBER1和EBER2）[10]。EB病毒的潛伏感染形式可分為潛伏III期、潛伏II期和潛伏I期，各個(gè)時(shí)期表達的蛋白有所不同，也分別與不同種類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)；潛伏III期表達：EBNA1,EBNA2,EBNA3,LMP1,LMP2，與淋巴瘤的發(fā)生相關(guān)；潛伏II期表達：EBNA1,LMP1和LMP2，與Hodgkin's淋巴瘤和非Hodgkin's淋巴瘤有關(guān)；潛伏I期表達：EBNA1，與Burkitt淋巴瘤和胃癌密切相關(guān)。正由于各時(shí)期所表達蛋白不同和致瘤種類(lèi)各異，因此，在研究特定腫瘤疫苗時(shí)，能夠有更強地針對性，也可以將兩種或多種蛋白整合，以提高疫苗治療相關(guān)疾病和腫瘤的幾率[8,11]。EBNA1是EB病毒潛伏感染時(shí)表達的一種病毒核抗原，其能調節EB病毒的復制，增強病毒基因的轉錄；并能維持病毒基因組的穩定性，使病毒能以附加體的形式穩定存在于被感染的細胞內。EBNA1包含多個(gè)CD4T細胞的靶向表位，可由特異性HLAII類(lèi)分子呈遞給T細胞，從而使EBNA1成為治療EBV相關(guān)疾病潛在的靶點(diǎn)。LMP1是EB病毒潛伏蛋白中研究最透徹的，其表達可誘導EB病毒感染和初始B細胞活化等一系列變化。包含HLAA2限制性L(fǎng)MP1肽段的多肽疫苗，能夠有效誘發(fā)強的CTL應答，并在HLAA2/Kb小鼠體內逆轉表達LMP1的腫瘤。LMP2是一種具有促進(jìn)生長(cháng)活性的膜信號蛋白，包含CD8T細胞靶向表位，由HLAI類(lèi)分子呈遞給T細胞。在多數EB病毒相關(guān)惡性疾病中，均表達EBNA1、LMP1和LMP2，甚至只表達該三種蛋白，而且這三種蛋白都可誘導機體產(chǎn)生CTL反應；在治療性疫苗的設計和研發(fā)中，通過(guò)對這編碼這三種蛋白基因進(jìn)行相應修飾和組合，誘發(fā)特異性CTL應答，達到治療目的。

 

EB病毒疫苗的設想，最早可追溯到1976年，Epstein[12]首先提出用疫苗預防EB病毒相關(guān)的惡性腫瘤或減少其發(fā)病率。目前，大部分防治EB病毒感染疫苗的研究集中于EB病毒的包膜糖蛋白gp350，不僅是因為EB病毒通過(guò)gp350與CD21結合感染細胞；而且gp350是EB病毒和被感染細胞上最豐富的糖蛋白，同時(shí)也是產(chǎn)生中和性抗體以抵御病毒感染首要的靶標。2007年，Sokal等[13]制備的重組gp350疫苗進(jìn)行了II期臨床試驗，試驗對象包括181位未被EB病毒感染、且身體健康的年輕人；試驗結果表明：該疫苗預防由EB病毒感染引起的傳染性單核細胞增多癥的有效率達到78%，并且產(chǎn)生的抗gp350抗體在體內留存時(shí)間超過(guò)18個(gè)月，同時(shí)該疫苗具有良好的安全性和免疫原性[14]，目前已著(zhù)力于III期臨床試驗的設計[4]；但是該重組疫苗不能有效預防無(wú)癥狀的EB病毒感染。2009年，Rees等[15]以慢性腎功能衰竭、只能等待器官移植的患者為研究對象，進(jìn)行了gp350疫苗I期臨床試驗，結果表明該疫苗具有良好地生物活性和免疫原性；試驗過(guò)程中發(fā)現，由于研究對象對該疫苗的特定反應，使得從初次接種該疫苗到最終實(shí)施器官移植的中值時(shí)間為24周，從而延遲了移植手術(shù)的進(jìn)行；后續臨床試驗需要在接種疫苗時(shí)使用配套改進(jìn)地佐劑，以縮短從初次接種到移植的時(shí)間，以降低移植后患者體內EB病毒載量和患移植后淋巴增生性紊亂疾病的幾率。

 

2013年，Cui等[16]在構建gp350載體的時(shí)候，以(Gly4Ser1)3為連接體將兩段完全一樣的gp350序列分割開(kāi)；隨后添加釀酒酵母GCN4亮氨酸拉鏈序列，利用其自連作用使gp350二聚體最終形成四聚體蛋白；并且所采用的gp350僅包括其前470個(gè)氨基酸序列，但包含有CD21的結合位點(diǎn)。在研究該四聚體gp3501-470的免疫原性和有效性時(shí)，以單體gp3501-470為對照，結果發(fā)現：四聚體形式的gp350，其免疫原性比單體gp350強25倍，與CD21結合的效率比單體形式高24倍；實(shí)驗結果也表明，所制備的四聚體gp350疫苗，能夠有效預防EB病毒感染宿主細胞，從而具有作為預防性疫苗的潛力。EB病毒的預防性疫苗主要以gp350為靶抗原，通過(guò)接種后刺激機體產(chǎn)生中和性抗體以阻斷病毒感染通路。確保疫苗的安全性和免疫原性是疫苗研發(fā)的首要原則，從上述臨床結果可以看出，gp350疫苗兼具良好的安全性和免疫原性，具有較好的預防效果；但對于無(wú)癥狀地或特定地EB病毒感染者不能有效地預防，使得疫苗的適用范圍大大減小；具有更強免疫原性的多聚體gp350疫苗，或許是好的解決方案。

 

 

EB病毒的核抗原EBNAs和膜蛋白LMPs能夠誘發(fā)宿主特異性地細胞免疫反應，為免疫治療提供了基礎。目前正在研究中的疫苗主要以L(fǎng)MP1,LMP2,EBNA1和EBNA3為靶抗原，通過(guò)單一或多個(gè)蛋白組合，構建病毒疫苗；接種后，誘導機體產(chǎn)生特異性T細胞免疫應答，通過(guò)特異性地細胞毒性T淋巴細胞作用清除表達相應靶抗原的腫瘤細胞，達到治療效果。

 

 

2003年，Duraiswamy等[17]通過(guò)重組一個(gè)痘病毒疫苗，其包含有編碼源于LMP1的HLAA2-限制表位的多肽蛋白；以EB病毒相關(guān)的Hodgkin's疾病和鼻咽癌患者為對象的臨床前試驗結果表明該疫苗能夠有效地被正常人的LMP1特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）識別，產(chǎn)生強烈地CTL應答；說(shuō)明該疫苗能夠通過(guò)免疫療法治療EB病毒相關(guān)的Hodgkin疾病和鼻咽癌。2012年，尉秀霞等[18]通過(guò)構建包含去除癌基因的LMP1△DNA疫苗，并與攜帶LMP1△基因的重組腺病毒疫苗聯(lián)合接種；初步結果得到，單獨的LMP1△基因DNA疫苗能夠誘導產(chǎn)生LMP1△特異性的CTL應答；與攜帶LMP1基因的重組腺病毒疫苗聯(lián)合使用后，能夠提高特異性細胞免疫應答水平。2009年，楊松梅等[19]聯(lián)合使用EB病毒LMP2的DNA疫苗、腺聯(lián)病毒疫苗和非復制5型腺病毒疫苗接種小鼠，該混合疫苗能夠有效地誘導機體產(chǎn)生針對EB病毒相關(guān)鼻咽癌的特異性細胞免疫應答，從而為鼻咽癌的防治提供一種可行的疫苗策略。2012年，曾毅院士主導研發(fā)的重組LMP2腺病毒疫苗就鼻咽癌的治療進(jìn)入I期臨床試驗，以驗證該疫苗的安全性和生物活性。2008年，Elliott等[20]以EB病毒核抗原3（EBNA3）上的HLAB0801限制性多肽FLRGRAYGL為基礎，制備出可誘發(fā)特異性CD8+T細胞應答的疫苗，并進(jìn)入I期臨床試驗；該疫苗旨在誘導針對EB病毒感染的T細胞免疫應答，并有效刺激機體產(chǎn)生抗EB病毒相關(guān)的惡性腫瘤；小量樣本臨床試驗結果也初步證明該疫苗能誘導機體產(chǎn)生病毒特異性CD8+T細胞應答。以單一病毒膜蛋白或核抗原為靶點(diǎn)的疫苗，在鼻咽癌的免疫治療方面已取得重要進(jìn)展；特別是我國自主研發(fā)治療鼻咽癌的重組LMP2疫苗已進(jìn)入臨床試驗，對我國進(jìn)行鼻咽癌的防治具有重大意義，因為全球80%的鼻咽癌患者在中國。

 

 

2010年，Lutzky等[21]在設計EB病毒疫苗時(shí)，為最大限度地提高機體的T細胞（包括CD4和CD8）識別EB病毒的幾率；利用重疊PCR技術(shù)將編碼EB病毒核抗原1（EBNA1）、LMP1和LMP2的基因合，然后插入到腺病毒載體中；使其在鼻咽癌的免疫治療中具有激活所有可能CD4+和CD8+T細胞應答的潛能，從而盡可能地識別并殺傷腫瘤細胞，達到治療目的。2012年，Chia等[22]公布了在晚期轉移性鼻咽癌患者身上使用一種腺病毒誘導的樹(shù)突細胞疫苗的II期臨床試驗結果，該腺病毒表達部分缺失的LMP1和全長(cháng)LMP2，試驗結果證實(shí)該疫苗兼具安全性和有效性。Hui等[23]在2013年報道了在鼻咽癌患者使用重組改良的安卡拉痘苗（MVA-EL）的I期臨床試驗結果，該重組疫苗編碼EB病毒的EBNA1和LMP2，以刺激機體的T細胞免疫應答。試驗實(shí)施過(guò)程中將不同劑量的疫苗接種不同的病人，結果發(fā)現，該疫苗具有明顯地劑量效應，即接種疫苗量最多的患者，具有更強地針對EBNA1和LMP2的細胞免疫應答；并且兼具安全性和良好的免疫原性、生物活性，為II期臨床試驗驗證疫苗的臨床效果、有效性提供堅實(shí)地基礎。該疫苗已經(jīng)從2013年3月開(kāi)始進(jìn)行為期三年的Ib期臨床試驗[24]，在更深入細致地研究疫苗安全性、免疫原性的同時(shí)，還將探討免疫系統是如何對該疫苗產(chǎn)生應答、疫苗的副作用以及加強疫苗接種對免疫系統的效應等。

 

 

2011年，德國的Ruiss等[25]制備出一種類(lèi)病毒材料，其結構與EB病毒類(lèi)似，并以此獲得一株細胞系，這個(gè)細胞系包括有基因修飾的EB病毒基因組；但是缺失所有潛在的病毒癌基因，只含有供裝配、釋放等必須的病毒蛋白。體內實(shí)驗結果表明，這種基于EB病毒的材料具有很強地免疫原性，能有效刺激機體產(chǎn)生CD4+和CD8+T細胞免疫應答。因此這種類(lèi)病毒材料不僅安全，也可以作為有效地EB病毒候選疫苗。這種以類(lèi)病毒材料為載體，與前述EB病毒疫苗常用的腺病毒和痘苗病毒載體，兼具安全性和免疫原性，具體臨床試驗結果有待進(jìn)一步研究；但無(wú)疑為EB病毒疫苗的研究提供更廣地思路和途徑。2013年8月，H.Polansky和E.Itzkovitz[26]公布了一種抗多種病毒（包括EB病毒、人乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人巨細胞病毒和丙型肝炎病毒）藥物的上市后臨床試驗結果，藥物名為：Gene-Eden-VIR。該藥物包含有五種天然的物質(zhì)成分：槲皮黃銅、綠茶萃取物、肉桂萃取物、甘草萃取物和硒。根據對60位、年齡在20歲以上被感染個(gè)體的試驗結果表明，該藥物能夠安全、有效地進(jìn)行抗EB病毒、人乳頭瘤病毒等病毒感染。

 

3結論與展望

 

綜上所述，EB病毒疫苗的研制已經(jīng)取得令人可喜的結果，多種疫苗已進(jìn)入臨床試驗。然而，在疫苗的研究過(guò)程中依然存在一些困難：1）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展期，缺乏一個(gè)好的腫瘤標志物[4，5]，使得后續的臨床試驗舉步維艱。2）在研究抗EB病毒感染和相關(guān)疾病時(shí)，缺乏相應地動(dòng)物模型。因為EB病毒具有很強的種屬特異性，且只感染人類(lèi)。早在1985年，Epstein等[27]用gp350接種棉冠絨猴后，能夠保護其不患EB病毒誘導的B細胞淋巴瘤；但是棉冠絨猴為瀕危物種，使得這種動(dòng)物模型的推廣大大受限。2012年，Zhang等[28]成功構建出一種臨床前的小鼠動(dòng)物模型，該小鼠能夠表達被B細胞特異性結合的改型EB病毒LMP1；實(shí)驗結果也揭示了LMP1在體內被EB感染的B細胞的免疫監視和轉化發(fā)揮重要角色，該模型也為B細胞淋巴瘤的治療提供新策略。隨著(zhù)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病毒、疫苗及免疫佐劑等相關(guān)方面的研究不斷深入，為EB病毒相關(guān)疾病和腫瘤的治療提供了新的策略。Ogembo等[29]研究發(fā)現人補體受體1（即CD35）也可以做為EB病毒的受體，CD35在EB病毒的初次免疫中扮演重要的角色，為解釋病毒趨性及gp350/220作為EB病毒疫苗的重要性提供了良好的基礎。與此同時(shí)，科學(xué)家們也致力于佐劑的研究，和疫苗聯(lián)合作用，提高機體的抗腫瘤免疫。CpG寡脫氧核苷酸序列能夠通過(guò)Toll樣受體9（TLR9）激活機體的固有免疫，可以作為佐劑加強機體的抗感染和抗腫瘤免疫[30，31]。Zuo等[32]于2011報道一種新的靶向基因療法，用于治療EBV相關(guān)的鼻咽癌；該方法采用RNA干擾技術(shù)，實(shí)驗結果發(fā)現其構建的非病毒載體mc-oriP-IFNγ上的增強子oriP能夠特異性地與鼻咽癌細胞的EBNA1結合；從而使具有抑制腫瘤生長(cháng)功能的IFNγ靶向到腫瘤部位發(fā)揮功能。在EB病毒疫苗的前期研究基礎之上，以及與不斷出現的最新研究成果和不同知識體系之間的相互借鑒、交融，對EB病毒的研究認識更加清晰、透徹，也為EB病毒相關(guān)疾病和腫瘤的預防和治療，奠定了堅實(shí)的理論和實(shí)踐基礎。