盡管研究了幾十年，但許多癌癥的原因似乎很大程度上仍然是未解之謎。不過(guò)，也有一些類(lèi)型的癌癥，其惡性驅動(dòng)因素已經(jīng)被置于聚光燈下。科學(xué)家知道，99%的宮頸癌病例是由人乳頭瘤病毒（HPV）引起的1。HPV是一種大的DNA病毒，可在粘膜的角質(zhì)化細胞、以及皮膚上形成感染，引起鱗狀細胞乳頭狀瘤或疣。如果HPV是大多數宮頸癌的成因，那么它是否也會(huì )導致某些皮膚癌？

HPV和宮頸癌之間的密切關(guān)聯(lián)引發(fā)了EmilieHultin博士的好奇：HPV和非黑色素瘤皮膚癌之間是否也存在關(guān)聯(lián)。作為瑞典卡羅林斯卡研究所的一名遺傳學(xué)家，Hultin博士的HPV研究已經(jīng)從芯片轉移到新一代測序(NGS)，以揭示非黑色素瘤皮膚癌中存在的新型HPV。憑借Illumina的HiSeq?、MiSeq?和NextSeq?系統，她的研究凸顯出NGS解決一部分醫學(xué)上最大謎題的能力。

揭開(kāi)HPV的秘密

Hultin博士的科學(xué)生涯是從瑞典斯德哥爾摩的皇家理工學(xué)院（KTH）開(kāi)始的，她研究的是化學(xué)工程。在攻讀博士期間，她致力于為開(kāi)展基于芯片的SNP基因分型和HPV分型開(kāi)發(fā)新的技術(shù)和方法。在工作了兩年之后，Hultin博士于2011年加入卡羅林斯卡研究所。她目前是JoakimDillner博士實(shí)驗室的一名研究協(xié)調員，負責研究組的深度測序實(shí)驗室。

Hultin和Dillner博士都對鑒定與各種人類(lèi)疾病（特別是癌癥）相關(guān)聯(lián)的病毒很感興趣。他們的工作主要集中在檢測HPV和宮頸癌之間的致病關(guān)聯(lián)。在生殖道中，某些類(lèi)型的高危HPV病毒更有可能讓宮頸細胞癌變，而低危的HPV病毒則僅限于引起生殖器疣。由于HPV也能感染皮膚，他們決定調查HPV-癌癥的關(guān)聯(lián)是否也包含非黑色素瘤皮膚癌。之所以將黑色素瘤排除在外，是因為它與日照有密切關(guān)聯(lián)。

“我們知道皮膚上有許多HPV病毒株，但不敢肯定它們是否引起非黑色素瘤皮膚癌，”Hultin博士談道。“要想確定關(guān)聯(lián)的存在，需要鑒定皮膚樣本中的少量HPVDNA。這不是一項輕松的任務(wù)。”

他們并不知道要尋找什么，因此他們在研究過(guò)程中使用了NGS。“芯片技術(shù)是針對已知的DNA序列，因此我們無(wú)法用它來(lái)鑒定新病毒，”Hultin博士說(shuō)。“NGS讓我們能對皮膚樣本中的所有DNA進(jìn)行測序，從而可以檢測新型HPV。”

Hultin博士加入Dillner博士的實(shí)驗室時(shí)，正趕上他們購買(mǎi)第一臺NGS測序儀，Roche454系統。研究團隊后來(lái)使用一個(gè)中心實(shí)驗室的ThermoFisherScientificIonTorrent測序系統。不久他們認識到，這兩臺系統都不能提供尋找新病毒所需的測序深度。“病毒信號淹沒(méi)在樣本中極大量的皮膚細胞DNA中，”Hultin博士說(shuō)。“實(shí)際上只有0.2%-0.5%的測序read是病毒DNA，其余都是人的。我們也需要一臺可以同時(shí)進(jìn)行多樣本分析的測序系統，這樣測序起來(lái)比較經(jīng)濟。如果每個(gè)測序運行只運行一個(gè)樣本，這太奢侈了。”

MiSeq系統揭開(kāi)皮膚中的HPV多樣性

MiSeq系統則是一個(gè)完美的替代，既滿(mǎn)足他們的深度測序要求，每次運行又能夠分析96個(gè)樣本。他們對MiSeq平臺、454和IonTorrent系統進(jìn)行了逐項比較，想看看每個(gè)系統的表現如何。MiSeq系統成功做到了，與其他系統相比，它提供更多reads，測序深度高出其他測序系統1000倍。然而，這項研究還不僅僅是測序儀之間的對決。Hultin博士和她的團隊利用這些系統開(kāi)展了一系列研究，尋找了142個(gè)不同皮膚樣本中的新型病毒，這些樣本來(lái)自患有光化性角化病、基底和鱗狀細胞癌的免疫抑制個(gè)體2。

EmilieHultin博士是瑞典卡羅林斯卡研究所的一名研究協(xié)調員

研究樣本包含了全基因組擴增和PCR擴增的樣本混合物。“對無(wú)偏好和偏好性樣本混合物進(jìn)行測序有一個(gè)優(yōu)勢，”Hultin博士說(shuō)。“當我們對無(wú)偏好的全基因組擴增材料進(jìn)行測序時(shí)，能夠檢測更多的HPV類(lèi)型，但同時(shí)也得到大量人類(lèi)序列。PCR擴增的樣本讓我們能夠獲得更多只含有HPV的序列。不過(guò)，我們也會(huì )錯過(guò)一些類(lèi)型的HPV，它們與我們使用的引物不匹配。”

兩種樣本的混合物需要用兩種不同的Illumina文庫制備試劑盒。“我們使用Nextera?DNALibraryPreparationKit來(lái)制備82個(gè)樣本的全基因組擴增文庫，只需要1-2天就能制備好所有樣本的文庫，”Hultin博士說(shuō)。“在制備樣本的同時(shí)可以對整塊板進(jìn)行分析是很方便的。”

“MiSeq系統鑒定出454和IonTorrent系統無(wú)法找到的HPV類(lèi)型。”

“我們也使用經(jīng)過(guò)特定PCR引物擴增的樣本，形成約450bp的擴增子，”Hultin博士補充道。“這個(gè)大小很合適，因此我們使用TruSeq?NanoDNALibraryPreparationKit來(lái)制備。我們跳過(guò)了片段化、末端修復和大小篩選的步驟，直接將測序接頭與PCR產(chǎn)物的末端連接。Illumina的文庫制備操作和MiSeq的流程大大減少了我們實(shí)驗室的手動(dòng)操作時(shí)間。”

這項研究發(fā)現了意想不到的多樣性，至少有396種HPV包含之前未鑒定出的229種假定病毒。相比之下，早期在454和IonTorrent系統上開(kāi)展的測序研究鑒定出273種不同的HPV，其中只有47種未知病毒。

Hultin博士說(shuō)：“之前認為，我們只會(huì )發(fā)現少量的幾種新型的HPV，因為對皮膚HPV的研究不太多。但完全沒(méi)想到皮膚HPV有著(zhù)如此極端的多樣性。MiSeq系統鑒定出了用454和IonTorrent系統所沒(méi)有找到的HPV類(lèi)型。”

在使用454和IonTorrent系統兩年后，Hultin博士轉到了MiSeq系統，這使她在研究上取得了更大的進(jìn)展。“我們轉到MiSeq系統之后，才達到我們所需的測序深度，并產(chǎn)生足以讓我們鑒定出新型HPV的數據，”Hultin博士說(shuō)。“這項研究的結果標志著(zhù)我們對HPV多樣性的認識有了根本的轉變。”

短讀長(cháng)測序鑒定新型HPV

研究團隊繼續開(kāi)展他們的研究，對血清、新鮮冷凍（FF）活檢樣本以及福爾馬林固定、石蠟包埋的（FFPE）皮膚樣本進(jìn)行測序。由于FFPE樣本中的DNA是高度降解的，他們認為較長(cháng)的序列也許能更好地鑒定新型HPV。不過(guò)在實(shí)際研究中，他們發(fā)現讀長(cháng)較短的雙端測序（151bp）為FFPE樣本帶來(lái)了最好的結果。

利用HiSeq和MiSeq系統，Hultin博士領(lǐng)導了一項后續研究，在91個(gè)皮膚樣本中尋找HPV，這些樣本來(lái)自角化棘皮瘤、光化性角化病和基底細胞瘤，包含FF活檢和FFPE樣本3。利用雙序列標簽在HiSeq系統上開(kāi)展的多重、雙端測序讓他們能以一種無(wú)偏好性的方式對樣本進(jìn)行測序。他們發(fā)現四種過(guò)去未知的假定HPV類(lèi)型，包括HPV197，它大量存在于不同的癌癥樣本中。HPV197與親緣關(guān)系最近的HPV只有75%是相同的。它的引物區域存在許多核苷酸差異，這可能抑制了PCR擴增。

“如果不使用無(wú)偏好性的方法，HPV197將無(wú)法被發(fā)現，”Hultin博士說(shuō)。“這種病毒大量存在于非黑色素瘤皮膚癌樣本中，似乎是一種非常重要的皮膚HPV類(lèi)型。”

向NextSeq500系統的轉變

2014年6月，Hultin博士在實(shí)驗室中添置了一臺NextSeq500系統，并為其性能激動(dòng)不已。研究團隊發(fā)現，無(wú)論他們是否開(kāi)展PCR擴增，NextSeq500系統都是完美之選。“NextSeq500系統讓我們能高效測序FFPE樣本，并通過(guò)FF活檢樣本組裝新病毒，”Hultin博士說(shuō)，“它帶來(lái)了更高的測序深度以及測序96個(gè)樣本混合物的能力。我們的研究大部分轉移到NextSeq500系統，只利用MiSeq系統進(jìn)行驗證或前期試驗研究。”

研究團隊的生物信息學(xué)pipeline是為雙端測序的數據優(yōu)化的。考慮到HPV這種病毒能夠整合到宿主基因組中，NextSeq500系統上的雙端測序讓Hultin博士能夠鑒定病毒的整合位置。“我們可以在堿基對的水平上進(jìn)行分析，看看這個(gè)堿基對是否對應這個(gè)病毒，以及下一堿基對是否對應到人類(lèi)基因組，”Hultin博士這樣解釋。

“如果不使用無(wú)偏好性的方法，HPV197將無(wú)法被發(fā)現。”

Hultin博士對NextSeq500系統的性能以及它的簡(jiǎn)單易用感到興奮不已。“MiSeq系統的培訓非常簡(jiǎn)單，我們想不到測序還可以更簡(jiǎn)單，”Hultin博士說(shuō)。“之后，我們接受了NextSeq500系統的培訓，意識到Illumina確實(shí)讓測序又變得輕松了很多。我們幾乎不需要任何培訓。”

癌癥和免疫系統疾病的病毒病因學(xué)

NGS打開(kāi)了一扇窗，讓人們了解到存在的HPV病毒類(lèi)型的數量。“幾年前，我們只知道大約100種不同的HPV病毒類(lèi)型，”Hultin博士指出。“而如今已經(jīng)鑒定出200多種類(lèi)型了。”

在HPV上獲得的成功讓研究人員能夠更廣泛地去了解病毒在癌癥以及那些削弱免疫系統的疾病和紊亂中的作用。諾貝爾獎獲得者、首個(gè)發(fā)現HPV作用的HaraldzurHausen博士提出，免疫抑制的個(gè)體更有可能患上由病毒引起的癌癥，因為他們自身的免疫系統不再能夠控制感染。艾滋病就是一個(gè)例子，患者患上非黑色素瘤皮膚癌的風(fēng)險更高，如卡波西肉瘤（Kaposi’ssarcoma）。

“NextSeq500系統讓我們能高效測序FFPE樣本，并通過(guò)FF活檢樣本組裝新病毒。”

Hultin博士及其團隊一直在尋找與免疫抑制相關(guān)的癌癥中的病毒特征，希望找到潛在的病毒關(guān)聯(lián)。他們也在開(kāi)展多發(fā)性硬化（MS）的研究，看看是否有病毒病因學(xué)的證據。Hultin博士已經(jīng)得到了多發(fā)性硬化患者在診斷前幾年采集的血清樣本，以鑒定病毒是否與多發(fā)性硬化相關(guān)聯(lián)。首次的NextSeq500系統測序運行已經(jīng)完成，研究正進(jìn)入確認階段。

盡管HPV在宮頸癌中的作用已逐漸清晰，但科學(xué)家對HPV及其他病毒在癌癥發(fā)展中的作用的認識才剛剛開(kāi)始。Hultin博士相信，更多類(lèi)型的癌癥可能有病毒病原學(xué)的證據，即使病毒感染不會(huì )自動(dòng)地引起癌癥。有了NGS的幫助，她相信最終能找到這些特征。