2003年的一個(gè)悶熱的下午，正在度假的西班牙微生物學(xué)家FranciscoMojica告訴他的妻子，他不打算回家了。多年來(lái)，Mojica一直在從事CRISPR研究，引導他進(jìn)入這個(gè)研究領(lǐng)域的是一次偶然的發(fā)現：一個(gè)神秘的細菌DNA片段被插入了其他病毒的序列。
這個(gè)不歸家的下午，后來(lái)成就了超過(guò)2000篇的文章，其中包括《Nature》、《Science》、《Cell》等頂級期刊的發(fā)表的文章。
Mojica博士和同事們偶然發(fā)現了一種古老的細菌性免疫防御系統，可以?xún)Υ娌《镜幕蛎艽a，如果將該系統比作警察，那它手里就有罪犯——病毒DNA的照片，那么任何之前侵略過(guò)該細菌的病毒會(huì )被立馬清除出去。
這一發(fā)現可不可以被用于編輯其他基因呢？可以。
2012年，EmmanuelleCharpentier博士（柏林感染生物學(xué)Max普朗克協(xié)會(huì )的成員）和JenniferDoudna博士（伯克利大學(xué)霍華德休斯醫學(xué)研究所的教授）的合作，證明了CRISPR系統（使用一種名為Cas9核酸酶）作為一種有效的基因編輯工具，能夠定位和切割幾乎任何DNA序列。
現在張鋒博士和GeorgeChurch博士如果能夠證明CRISPR/Cas9可以編輯人體內的基因，那么生物技術(shù)的革命暴風(fēng)雨，將瞬間席卷全世界。
在過(guò)去的6個(gè)月中，我們看到了人類(lèi)胚胎致病基因編輯的重大進(jìn)展，包括基因編輯工具的拓展：RNA編輯器、CRISPR系統和超精密的基礎編輯系統。
那么在2017年，有哪些巔峰的CRISPR編輯系統的進(jìn)展，值得我們在這一年的年尾反復回味呢？
1.MaloryeAllisonBranca——CRISPR系統將改變臨床的格局
2017年2月份，《Nature》子刊指出CRISPR編輯與測序技術(shù)相結合，可以大大提升
遺傳篩查的效率。
3月份，《Nature》發(fā)表斯隆凱特林癌癥紀念中心的論文，利用CRISPR編輯構建強效CAR-T細胞研究論文，實(shí)現腫瘤的超強殺滅效果。
而如果說(shuō)起基因編輯技術(shù)，就不得不提中國。2016年10月四川大學(xué)的LuYou教授第一個(gè)進(jìn)行了CRISPR實(shí)驗，他在肺癌患者的肺中注入能夠降低PD-1活性的免疫細胞。雖然實(shí)驗結果有效性被頗多人質(zhì)疑，但是毫無(wú)疑問(wèn)，這是一項創(chuàng )舉。
CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1是目前廣泛使用的基因編輯系統。目前來(lái)看，CRISPR臨床前研究的結果振奮人心，例如血友病、杜氏營(yíng)養不良癥、眼部疾病或是甲狀腺素運載蛋白淀粉樣變性的治療。
隨著(zhù)CRISPR基因編輯的技術(shù)發(fā)展，其應用于臨床的前景必將無(wú)比寬闊。
2.DeeAnnVisk博士——基因編輯系統的裝備庫
擴大CRISPR/Cas9的規模需要進(jìn)行相關(guān)的結果驗證。最簡(jiǎn)單的方法就是設計相關(guān)的基因庫或檢測試劑盒，使得CRISPR/Cas9越來(lái)越成熟。
Vermeulen博士對CRISPR/Cas9進(jìn)行多組實(shí)驗后發(fā)現，CRISPR編輯技術(shù)可以永久修改基因組DNA而不是暫時(shí)改變RNA的表達水平。DNA的合成能力近年來(lái)突飛猛進(jìn)，研究人員能合成更長(cháng)的DNA并且可以進(jìn)行質(zhì)粒的組裝，從而簡(jiǎn)化CRISPR基因庫的制備。
ATI可以用來(lái)評估CRISPR誘發(fā)突變的細胞系。通過(guò)使用高活性的T7核酸內切酶及相應儀器可以加快CRISPR的實(shí)驗進(jìn)程。長(cháng)片段的PCR擴增技術(shù)已被高度選擇性的T7DNA酶所取代。含有綠色熒光蛋白（GFP）標記的啟動(dòng)子可以解決二倍體細胞系中兩個(gè)DNA突變鑒別的問(wèn)題。這種標記可以用來(lái)評價(jià)細胞中被替換基因的啟動(dòng)子強度。
3.KateMarusina博士——懷疑論者的“毀滅帝”
在人類(lèi)的感覺(jué)器官中，最容易受損的就是
聽(tīng)力，而超過(guò)50%是遺傳導致的。
為了對此進(jìn)行研究，科研人員利用斑馬魚(yú)進(jìn)行試驗。聽(tīng)力受損的斑馬魚(yú)表現出一種特征性的循環(huán)游泳行為，以此來(lái)與野生型進(jìn)行區分。研究人員利用基因編輯技術(shù)和轉錄激活因子核酸酶（TALENs），使得隱性純合子的胚胎表達降低。而這個(gè)結果，大大減少了斑馬魚(yú)的遺傳性聽(tīng)力損失。
4.MaryAnnLabant——基因編輯造福器官移植
利用CRISPR/Cas9技術(shù)，人類(lèi)可以解決跨物種移植這個(gè)難題，解決人體組織器官的嚴重短缺。考慮到倫理和兼容性，器官移植一開(kāi)始把重點(diǎn)放在豬的器官上。然而，1997年發(fā)生的豬內源性逆轉錄病毒事件使得全球禁止進(jìn)行豬器官的移植，人類(lèi)將所有的希望集中在轉基因豬上。隨后科學(xué)家在PK15
豬腎上皮細胞上進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗根除了豬內源性逆轉錄病毒。
Milliporesigma公司推出了各種CRISPR產(chǎn)品，為廣大科研人員服務(wù)。milliporesigma和威康信托基金桑格研究所經(jīng)過(guò)兩年的合作，開(kāi)發(fā)出了第一個(gè)基因組文庫篩選系統，從而減少了實(shí)驗的時(shí)間。
5.MaryAnnLabant——基因編輯路在何方
CRISPR-Cas9基因編輯系統相較于經(jīng)典的基因治療所需時(shí)間更短，且基因組編輯組件可以被加載到病毒載體中，加速臨床開(kāi)發(fā)。早期的基因組編輯使用的是鋅指核酸酶的方法（ZFN）。而CRISPR-Cas9的出現為基因編輯注入了新的活力。但CRISPR-Cas9有一定的局限性，例如靶向性和特異性。CRISPR目前只是用來(lái)輔助治療CAR-T細胞以增強其療效。
那么現在，CRISPR基因編輯技術(shù)可以用來(lái)做什么？
基因組CRISPR篩選識別調控蛋白
利用CRISPR進(jìn)行遺傳篩選可以控制相關(guān)遺傳物質(zhì)。研究人員構建了由同一啟動(dòng)子表達的綠色熒光蛋白（GFP），然后在其中一組的細胞啟動(dòng)子和GFP之間插入了目標基因調控元件，另一個(gè)組則沒(méi)有。在幾個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)通過(guò)對兩組細胞進(jìn)行流式細胞儀分離細胞，檢測相應的熒光強度。通過(guò)這一實(shí)驗，我們能夠篩選人類(lèi)蛋白編碼基因，并確定負責調控相關(guān)蛋白的調節基因。
CRISPR/Cas9能夠加快HIV的篩查
和治療
多年來(lái)，高通量陣列基因組篩選技術(shù)一直是探究生物相關(guān)通路的標準，用來(lái)研究相應的生物學(xué)機制。CRISPR/Cas9的基因敲除技術(shù)具有高通量檢測的優(yōu)勢，它能轉化CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）與CRISPRRNACas9蛋白的合成和引物RNA。這項研究的重點(diǎn)是確定艾滋病毒感染的新靶點(diǎn)。通過(guò)表型、基因編輯率和基因敲除等方法驗證了研究方法的準確性。作者在排除了幾個(gè)宿主因子的影響后，證實(shí)了預期的表型，發(fā)現了新的基因靶點(diǎn)。因此，他們展示了利用CRISPR基因敲除篩選方法來(lái)確定HIV發(fā)病與新感染宿主之間的關(guān)系。
克服克隆篩選的瓶頸
CRISPR/CAS系統的瓶頸在于對含有致突變和雜合性的克隆體的測序。雖然可以用篩選方法加以解決，但成本和時(shí)間大大增加。目前，科學(xué)家們正在轉向低成本的篩選方法。AATI已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一個(gè)強大的T7核酸內切酶法，能夠與片段分析儀無(wú)縫集成，用來(lái)對CRISPR基因編輯的精度進(jìn)行測定。
高度特異的基因組編輯：
alt-rS.P.HIFICas9核酸酶3nls
許多研究者關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題是CRISPR/Cas9系統潛在的脫靶效應。通過(guò)對alt-rCRISPR-Cas9系統-alt-r化膿性鏈球菌HIFICas9核酸酶3nls進(jìn)行高效基因組編輯后，其基因編輯效率和精度都大幅提升。IDT的科學(xué)家利用Cas9核酸酶使該系統變成更精確的基因組編輯工具。通過(guò)對250000多個(gè)突變體進(jìn)行實(shí)驗后，他們認為這種酶能有效解決脫靶現象的發(fā)生。它的優(yōu)越性能已經(jīng)得到了許多實(shí)驗室的驗證，這些實(shí)驗室對各種生物系統進(jìn)行了相應的轉化研究。
杰克遜實(shí)驗室的模型建立服務(wù)（MGS）團隊已經(jīng)廣泛使用CRISPR技術(shù)創(chuàng )造轉基因小鼠，他們建立的模型是B淋巴細胞的類(lèi)開(kāi)關(guān)重組突變體，這在研究1型糖尿病的發(fā)展中至關(guān)重要。研究人員使用經(jīng)CRISPR處理過(guò)的雙陰性Aidca基因小鼠與野生型小鼠進(jìn)行比較，雙陰性Aidca基因小鼠的1型糖尿病發(fā)病率更低。結果表明利用CRISPR技術(shù)修改Aidca基因能夠顯著(zhù)降低1型糖尿病的發(fā)生率。
CRISPR轉染技術(shù)治療
多個(gè)單基因突變的艾滋病的發(fā)展
CRISPR是一個(gè)突破性的技術(shù)，但無(wú)論是在基礎研究中或作為一種治療劑，CRISPR基因編輯都必須進(jìn)入相關(guān)的細胞群中才能發(fā)揮作用。因此在更為復雜的研究或是臨床研究中，CRISPR轉染細胞往往比較困難。MaxCyte是基于流式電穿孔技術(shù)的基因編輯器，它具有轉染效率高和細胞存活率高的特點(diǎn)。
加快分析CRISPR/Cas9
產(chǎn)品自動(dòng)化編輯效率的測量
利用CRISPR/Cas9進(jìn)行精確的基因修飾需要強大的分析工具來(lái)驗證目標是否突變成功，并測量實(shí)驗的效率。傳統的CRISPR/Cas9分析的瓶頸是難以處理大劑量的樣品。經(jīng)典分析方法費時(shí)費力，不適于高通量分析。PerkinElmer芯片實(shí)驗室的GX核酸分析儀采用相關(guān)的微電流技術(shù)，減少了樣本測序的數量，大大縮短時(shí)間。
代理CRISPR實(shí)驗
Milliporesigma具有高效的研發(fā)CRISPR功能實(shí)用性的能力。MilliporeSigma能使不具備DNA切割活性的dspCas9突變并將它放置在CRISPR系統附近，使其產(chǎn)生巨大的DNA切割活性。CRISPR代理實(shí)驗可以提高三個(gè)方面的內容：（1）提高基因組編輯的能力，包括基因敲除和插入；（2）增加靶向性，成倍增加目標基因的靶向性；（3）降低目標基因的切割頻率。
在更為自然的生物環(huán)境中
進(jìn)行蛋白質(zhì)生物學(xué)研究
標記序列常常被整合到表達蛋白中，從而對蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行鑒定。然而，許多大尺寸的標記物插入效率低，并且檢測通常僅限于抗體層面，導致這些方法使用受限。Promega公司的科學(xué)家們通過(guò)一種11個(gè)氨基酸的肽標簽敏感的生物發(fā)光檢測方法，來(lái)克服CRISPR編輯的局限性。
我們已經(jīng)不再為CRISPR編輯系統的突破感到驚訝，衷心希望這個(gè)領(lǐng)域的突破可以盡快推動(dòng)到臨床，幫助人類(lèi)真正戰勝各類(lèi)遺傳病。
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