近視是世界上導致視力下降最主要的原因。隨著(zhù)過(guò)去20年近視發(fā)病率的不斷增高，目前它已成為一個(gè)主要的公共健康問(wèn)題。在2000年，有14.06億人是近視眼（占世界人口的22.9%），其中高度近視的有1.63億人（占世界人口的2.7%）。預計到2050年，近視人群將達到世界人口的49.8%，高度近視將達到9.8%。盡管近視可以通過(guò)框架眼鏡等進(jìn)行屈光矯正，但是它會(huì )明顯增加其他致盲性眼病的風(fēng)險，比如近視性黃斑病變，視網(wǎng)膜脫離，青光眼，白內障等。雖然增加戶(hù)外活動(dòng)時(shí)間，使用OK鏡以及局部阿托品等方法對于近視進(jìn)展有延緩作用，但是由于他們的作用機制以及近視的發(fā)病機制不明，因此效果有限。因此迫切需要一個(gè)能更好解釋近視發(fā)病的理論，且能發(fā)展安全有效的治療措施。

近視的發(fā)展與眼軸的過(guò)度增長(cháng)有關(guān)，在近視的動(dòng)物模型和人類(lèi)中，這種改變常常伴隨著(zhù)鞏膜的變薄，而鞏膜正是能維持眼球形狀和完整的重要組織。在不同近視模型中的鞏膜改變，促進(jìn)了鞏膜在近視發(fā)展中潛在機制的研究。這些研究已經(jīng)表明近視相關(guān)的鞏膜細胞外基質(zhì)（ECM）的重塑與ECM成分的合成減慢和分解加速有關(guān)。因此破壞了鞏膜結構的完整性，導致眼軸的增長(cháng)。可如何引起這些改變的機制仍舊不明，其中的關(guān)鍵性問(wèn)題是近視相關(guān)的鞏膜ECM重塑是如何被誘發(fā)的。一種假設是視網(wǎng)膜的視覺(jué)信號產(chǎn)生一種我們未知的分子，并在脈絡(luò )膜中啟動(dòng)反應。緊接著(zhù)脈絡(luò )膜產(chǎn)生信號并傳遞到鞏膜并誘導ECM的重塑。

哺乳動(dòng)物的鞏膜是由單一的纖維層組織組成，包含有各類(lèi)異質(zhì)的細胞群，如成纖維細胞和肌成纖維細胞，以及巨噬細胞和樹(shù)突狀細胞。但是既往由于實(shí)驗的難度，很難將這些不同的鞏膜細胞分離開(kāi)并對他們進(jìn)行特異性的分析。因此到目前為止，研究者都是將鞏膜組織進(jìn)行整體研究。但是這種方法就限制了研究者在鞏膜誘導近視發(fā)展中發(fā)現局部和細胞特異性的信號分子的改變。而單細胞RNA測序技術(shù)的出現能很好的解決視網(wǎng)膜中存在不同細胞類(lèi)型的復雜問(wèn)題。因此在本研究中，研究者就利用了單細胞RNA測序的技術(shù)，來(lái)檢測鞏膜組織中不同細胞類(lèi)型的基因表達情況，是如何導致細胞的表型改變的（成纖維細胞到肌成纖維細胞），以及在近視發(fā)展中鞏膜的ECM的變化。研究結果發(fā)表在PNAS雜志上。

首先從行覺(jué)剝奪（近視模型）和對側眼正常的小鼠眼球的鞏膜中分離出93個(gè)單細胞，并對他們進(jìn)行轉錄組的分析，在剔除掉22個(gè)的細胞后，剩余的71個(gè)細胞均表達成纖維細胞的標記基因（Vim,Col1a1,Col1a2,S100a4,Acta2,Postn,Fap,Ddr2）（圖1A）。通過(guò)計算71個(gè)鞏膜成纖維細胞每個(gè)基因表達水平的平方變異系數（CV2），我們確定了4463個(gè)基因在表達上具有異質(zhì)性（圖1B）。將這些基因進(jìn)行層次聚類(lèi)分析（圖1C），可以將這71個(gè)細胞分類(lèi)成2種主要的類(lèi)型，可以稱(chēng)為A1和A2，分別包含20個(gè)和51個(gè)細胞。雖然A1和A2兩種纖維細胞類(lèi)型均存在于行覺(jué)剝奪和正常的眼中，但是A2細胞的比例在行覺(jué)剝奪的眼中明顯高于正常眼（圖1D）。通過(guò)成纖維細胞和肌成纖維細胞標記基因表達的高低，可以定義A1細胞為靜止的成纖維細胞（成纖維樣細胞），A2細胞為肌成纖維細胞或者是由成纖維細胞分化為肌成纖維細胞過(guò)程中的中間狀態(tài)的細胞（肌成纖維樣細胞）。從成纖維樣細胞到肌成纖維樣細胞轉化的過(guò)程中發(fā)現有660個(gè)基因具有明顯的改變（P<0.05,TPM>2或者<0.5）。通路分析發(fā)現差異表達的基因明顯聚集于26條通路中，且其中有9條通路顯示出顯著(zhù)的預測活性模式（圖2A）。最頂端的富集通路分別是eIF2信號，mTOR信號和心血管系統中的缺氧信號通路，這些信號通路均對缺氧起調節反應，這些改變提示這些缺氧相關(guān)的信號通路可能在行覺(jué)剝奪的眼中被激活。為了證明由單細胞RNA測序分析得到的相關(guān)信號通路的作用，研究者在行覺(jué)剝奪的小鼠上用RT-PCR來(lái)檢測3條通路中8個(gè)差異表達基因的mRNA表達水平。與單細胞RNA測序的結果一致，這8個(gè)基因的mRNA表達在行覺(jué)剝奪小鼠的鞏膜中明顯升高，但是也發(fā)現在視網(wǎng)膜中的表達沒(méi)有改變。這些結果均證明鞏膜成纖維細胞中的eIF2，mTOR和缺氧信號通路均與近視的發(fā)展相關(guān)。

圖1.A.確定細胞類(lèi)型的標記物的表達B.紅線(xiàn)代表基因的平均表達水平，粉紅點(diǎn)代表差異基因的CV2低于觀(guān)察值C.根據TPM將71個(gè)鞏膜細胞進(jìn)行層次聚類(lèi)分析，X軸代表差異基因，Y軸代表鞏膜細胞，其中粉色為行覺(jué)剝奪眼，藍色為正常眼D.A1和A2細胞在正常眼和行覺(jué)剝奪眼中的比例，A2細胞在行覺(jué)剝奪眼和正常眼占的的比例分別為85.7%和58.3%（P=0.021）。

為了找到細胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵分子，研究者又根據分層聚類(lèi)的結果將肌成纖維樣細胞分成4個(gè)亞組（圖2B）。通過(guò)分析及相關(guān)性最后發(fā)現HIF-1α在成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞的過(guò)程中起關(guān)鍵作用（圖2C）。然后利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò )來(lái)研究近視相關(guān)的風(fēng)險基因與信號通路的關(guān)系，發(fā)現HIF-1α分別與近1/3（45/145）的近視風(fēng)險基因相關(guān)，10個(gè)（10/27）病理性近視相關(guān)的風(fēng)險基因相關(guān)（圖2D）。

圖2.A.通路分析P<0.01且絕對激活分值>2的通路，除了PPAR/RXRα是被抑制，其余通路在A(yíng)2細胞中均被激活B.A2亞群細胞的聚類(lèi)分析C.不同細胞和亞組細胞的Hif1a表達D.人類(lèi)病理性近視相關(guān)的風(fēng)險基因與HIF-1α信號通路的關(guān)系

為了證明鞏膜缺氧是近視的一個(gè)特征，在行覺(jué)剝奪2天和2周的小鼠，用Westernblot檢測鞏膜中HIF-1α的表達明顯高于對照組，但是在視網(wǎng)膜中卻沒(méi)有差異。并且在行覺(jué)剝奪2周后，小鼠眼軸變長(cháng)。為了進(jìn)一步驗證，在行覺(jué)剝奪和負透鏡誘導2天和1周的豚鼠近視模型中，發(fā)現鞏膜中HIF-1α的表達明顯升高，而在去除誘導因素2天后，表達水平也恢復正常，而視網(wǎng)膜中的表達始終未發(fā)現變化。繼續探索鞏膜缺氧在近視中的作用，研究者在體外將人類(lèi)鞏膜成纖維細胞暴露在缺氧的環(huán)境下，發(fā)現HIF-1α蛋白及肌成纖維細胞的標記蛋白表達增加，成纖維細胞的標記蛋白表達減少，表明缺氧可能是通過(guò)鞏膜肌成纖維細胞的分化來(lái)影響近視發(fā)展的。

而在行覺(jué)剝奪的豚鼠眼周注射抗缺氧的藥物（紅景天和芒柄花素）4周，發(fā)現HIF-1α的表達上調明顯被抑制，COL1α1的表達下調也被抑制，而α-SMA的表達沒(méi)有差別（圖3A和B）。更為重要的是，連續4周注射紅景天高劑量組（10ug/每天）比低劑量組（1ug/每天）控制近視進(jìn)展的效果更好（圖3C），眼軸的和玻璃體的長(cháng)度也更短（圖3D和E）。而連續4周注射芒柄花素高劑量組（5ug/每天）與低劑量組（0.5ug/每天）相比沒(méi)有差別，但與空白組相比明顯控制近視進(jìn)展（圖3F）,眼軸和玻璃體的長(cháng)度兩組也沒(méi)有差別，但也都明顯短于空白組（圖3G和H）。相反，在正常的豚鼠中注射紅景天和芒柄花素并不會(huì )引起屈光，眼軸和玻璃體長(cháng)度的任何改變。同時(shí)研究者也發(fā)現在注射抗氧化藥物后，行覺(jué)剝奪豚鼠的eIF2α和mTOR的磷酸化水平降低，而通過(guò)注射eIF2α和mTOR磷酸化抑制劑，可以控制行覺(jué)剝奪小鼠的近視進(jìn)展，這些結果都證明了缺氧相關(guān)的信號通路在近視發(fā)展中的作用。

圖3.A.在正常眼和行覺(jué)剝奪眼注射紅景天，行覺(jué)剝奪眼HIF-1α的表達上調明顯被抑制，COL1α1的表達下調被抑制，而α-SMA的表達沒(méi)有差別;正常眼均沒(méi)有差別B.在正常眼和行覺(jué)剝奪眼注射芒柄花素，行覺(jué)剝奪眼HIF-1α的表達上調明顯被抑制，COL1α1的表達下調被抑制，而α-SMA的表達沒(méi)有差別；正常眼均沒(méi)有差別C.注射紅景天高劑量組比低劑量組控制近視進(jìn)展效果更好D,E.射紅景天高劑量組比低劑量組眼軸和玻璃體長(cháng)度更短F.注射芒柄花素高劑量組與低劑量組相比控制近視進(jìn)展沒(méi)有差別，但與空白組相比有明顯差別G,H:注射芒柄花素高劑量組與低劑量組相比眼軸和玻璃體的長(cháng)度沒(méi)有差別，但也都明顯短于空白組

綜上研究結果，研究者提出近視相關(guān)的視覺(jué)信號可以造成脈絡(luò )膜毛細血管和血流的降低，導致對周?chē)鸁o(wú)血管鞏膜的氧氣和營(yíng)養成分供給減少，鞏膜缺氧由此出現，隨之HIF-1α的表達上調，eIF2α和mTOR的磷酸化水平增高，并促進(jìn)肌成纖維細胞的轉化和膠原蛋白的減少，這些導致鞏膜ECM的重塑，使得鞏膜變得薄弱，最終導致眼軸增長(cháng)和近視的發(fā)展（圖4）。當然還需要更多的實(shí)驗來(lái)證明脈絡(luò )膜與鞏膜間相互作用的詳細機制。

該項研究不僅為我們提供了一個(gè)理解近視發(fā)病機制的概念，也為我們提出了可以控制近視進(jìn)展的可行方法。

參考文獻：WuH,ChenW,ZhaoF,etal.Scleralhypoxiaisatargetformyopiacontrol.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.2018;115:E7091-E7100

短評：

毋庸置疑，近視已經(jīng)成為一個(gè)全球性公共健康問(wèn)題，不僅因為其發(fā)病率增長(cháng)，程度加重以及發(fā)病年齡提前的顯著(zhù)性趨勢，更因為就目前而言，在多種高發(fā)疾病逐漸被關(guān)注、被成功防治的先進(jìn)醫療環(huán)境下，針對近視的預防和治療在大部分時(shí)候仍是汲深綆短，而造成這一現狀的主要原因則是對近視發(fā)病機制的不清楚，不理解，和不深入。本研究從鞏膜缺氧作為著(zhù)眼點(diǎn)，成功指出鞏膜缺氧對近視的促發(fā)作用，因此進(jìn)一步解釋了近視發(fā)生時(shí)ECM的薄弱和病態(tài)重塑，使抑制和治療鞏膜缺氧有望成為近視防控的重要突破點(diǎn)，具有深遠的基礎和臨床意義。