視錐細胞是視網(wǎng)膜重要的感光細胞，主要負責中心敏銳視力和辨色力。根據光譜吸收特性的不同，可以將視錐細胞分為3類(lèi)：藍錐細胞（短波長(cháng)；S）、綠錐細胞（中波長(cháng)；M）和紅錐細胞（長(cháng)波長(cháng)；L）。視錐細胞先分化為S或者L/M（圖1A），而后向L/M分化的細胞再選擇表達L或M視蛋白。影響視蛋白表達或者功能的基因突變會(huì )導致多種形式的色盲和視網(wǎng)膜變性。我們通過(guò)生物體模型對脊椎動(dòng)物眼睛的各種機制有了較多了解，但對人類(lèi)視網(wǎng)膜單獨一種視錐細胞亞型的發(fā)生機制了解甚少。本文研究者通過(guò)干細胞分化視網(wǎng)膜類(lèi)器官來(lái)研究人類(lèi)視網(wǎng)膜視錐細胞各亞型的機制（圖1D-K），研究結果發(fā)表在Science雜志上。

A.視錐細胞的分化選擇B.人類(lèi)視網(wǎng)膜中S，L/M細胞的比例C.類(lèi)器官中S，L/M細胞的比例D-K.iPSC誘導分化為類(lèi)器官的過(guò)程

研究者首先比較了分化的視網(wǎng)膜類(lèi)器官和成人視網(wǎng)膜組織的視錐細胞亞型特點(diǎn)。發(fā)現成人視網(wǎng)膜與分化200天視網(wǎng)膜類(lèi)器官有相似的視錐細胞亞型構成比（成人，S=13%，L/M=87%；類(lèi)器官，S=29%，L/M=71%）（圖1B和C）；兩者比例的差別可能因為視網(wǎng)膜類(lèi)器官在6個(gè)月時(shí)還未完全分化成熟。而且視網(wǎng)膜類(lèi)器官中的S和L/M細胞均表達了CRX（一種感受器分化的關(guān)鍵轉錄因子）（圖2A和E）。另外類(lèi)器官和視網(wǎng)膜中的視錐細胞形態(tài)相似：L/M細胞比S細胞外節部分更長(cháng)，內節部分更寬（圖2B-D，圖F-H）。類(lèi)器官中視錐細胞的外節部分比成人視網(wǎng)膜要短，而這也與出生后視網(wǎng)膜的成熟過(guò)程相一致（圖2D和H）。因此，干細胞分化視網(wǎng)膜類(lèi)器官中的視錐細胞在分布、基因表達、形態(tài)上均與人類(lèi)視網(wǎng)膜相似。

在人類(lèi)視網(wǎng)膜中，S細胞產(chǎn)生于胚胎11-34周，L/M細胞產(chǎn)生于胚胎14-37周，因此研究者又對視網(wǎng)膜類(lèi)器官視錐細胞的發(fā)育進(jìn)行了研究，首次觀(guān)察到S-視蛋白表達的時(shí)間為150天（圖2I，L，M），S細胞的表達水平在170天開(kāi)始下降（圖2M），同時(shí)L/M視蛋白開(kāi)始表達，且表達的量逐漸增加直至第300天（圖2K-M）。在人類(lèi)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜類(lèi)器官中觀(guān)察到視錐細胞的先后表達說(shuō)明在視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中首先特異性表達S細胞，后轉變?yōu)樘禺愋员磉_L/M細胞。接下來(lái)研究者又對誘導多功能干細胞（iPSC）起源的視網(wǎng)膜類(lèi)器官進(jìn)行RNA測序，發(fā)現S視蛋白RNA在第111天開(kāi)始表達，在第160天表達開(kāi)始下降，而L/M視蛋白RNA在第160天開(kāi)始表達并逐漸增加，直到第180天后表達穩定。這些時(shí)間節點(diǎn)在類(lèi)器官和胎兒視網(wǎng)膜中均高度一致，因此類(lèi)器官的諸多方面均與人類(lèi)視網(wǎng)膜相似，可以作為一個(gè)揭示視網(wǎng)膜感光細胞發(fā)展變化機制的模型。

類(lèi)器官中視錐細胞亞型特征與人類(lèi)視網(wǎng)膜中相一致，A,C-E,G-M:類(lèi)器官中視錐細胞的表達B,D,F,H:人類(lèi)視網(wǎng)膜中視錐細胞的表達L:類(lèi)器官發(fā)育過(guò)程中S：L/M細胞的比例M:在類(lèi)器官發(fā)育中S和L/M細胞的密度N:S-視蛋白的表達早于L/M-視蛋白，CRX的表達早于視蛋白。

既往研究表明Thrв2是視錐細胞分化的關(guān)鍵調控分子，但是研究者利用CRISPR/Cas9在胚胎干細胞（ESC）中將Thrв2敲除，但是由此獲得的類(lèi)器官視錐細胞各類(lèi)型比例與野生型類(lèi)器官沒(méi)有差別（野生型，S=62%，L/M=38%；Thrв2KO，S=59%，L/M=41%；P=0.83）（圖3A-C）。研究者再次利用CRISPR/Cas9將Thrв（Thrв1和Thrв2）敲除，發(fā)現基因敲除的視網(wǎng)膜類(lèi)器官視錐細胞均分化為S細胞（野生型，S=27%，L/M=73%；ThrвKO;S=100%，L/M=0%；P<0.0001）（圖3D,E,H）。在這些突變類(lèi)器官中，所有的視錐細胞均表達S-視蛋白和表現出S細胞的形態(tài)（圖3I和J）。因此Thrв是人類(lèi)視網(wǎng)膜中激活L/M細胞和抑制S細胞的重要作用基因。

Thrв對三碘甲狀腺原氨酸（T3）有高親和力，既往在小鼠實(shí)驗中改變T3的含量可能會(huì )影響視錐細胞的比例。因此研究者假設T3是通過(guò)Thrв來(lái)影響視錐細胞分化的。在類(lèi)器官中，在20到50天起開(kāi)始加入20nMT3，直到第200天，發(fā)現視錐細胞大多數均分化為L(cháng)/M細胞（野生型，S=27%，L/M=73%；野生型+T3，S=4%，L/M=96%；P<0.01）(圖3F和H)。說(shuō)明早期加入T3可促進(jìn)L/M細胞分化，抑制S細胞。而在ThrвKO的類(lèi)器官中加入T3,卻只有S細胞（野生型+T3，S=4%，L/M=96%；ThrвKO+T3，S=100%，L/M=0%；P<0.0001）(圖3F-H).因此T3是通過(guò)Thrв來(lái)促進(jìn)L/M細胞分化和抑制S細胞的。

.A.WT類(lèi)器官視錐細胞B.Thrв2敲除類(lèi)器官視錐細胞C.WT和Thrв2KO的視錐細胞比例沒(méi)有差別D：WT類(lèi)器官視錐細胞E：Thrв敲除類(lèi)器官視錐細胞F:WT中加入T3的類(lèi)器官視錐細胞G:Thrв敲除類(lèi)器官中加入T3視錐細胞H:D,E,F,G中視錐細胞比例的差別I:幾種類(lèi)器官視錐細胞外節部分長(cháng)度J:幾種類(lèi)器官視錐細胞內節部分長(cháng)度K:幾種類(lèi)器官視錐細胞的比例差別

接著(zhù)研究者在類(lèi)器官發(fā)育的過(guò)程中對其進(jìn)行持續的基因表達檢測，直到第250天，根據甲狀腺激素的表達模式可分為三個(gè)階段：改變表達（圖4A），持續表達（圖4B）和無(wú)表達（圖4C），而降解T3和T4的酶的基因DIO3，在早期高表達，而在后期低表達（圖4A）。相反，將T4轉變?yōu)門(mén)3的酶的基因DIO2，在早期低表達，而隨后表達逐漸增加。因此Dio3和Dio2表達的動(dòng)態(tài)變化支持早期低水平的甲狀腺激素信號產(chǎn)生S細胞，而后期高水平的甲狀腺激素信號產(chǎn)生L/M細胞。而Thrв的表達也逐漸增加，與視錐細胞的分化相一致（圖4A）。而T3/T4的轉錄因子，輔酶因子也都隨著(zhù)類(lèi)器官的發(fā)育而動(dòng)態(tài)表達（圖4A和B）。這些均說(shuō)明Thrв和其他轉錄調控因子可以對不同的甲狀腺激素水平進(jìn)行調控反應。促甲狀腺激素釋放激素（TRH）也在類(lèi)器官和視網(wǎng)膜中動(dòng)態(tài)表達。因此視網(wǎng)膜是通過(guò)內部來(lái)調控T3和T4的水平，早期低水平的甲狀腺激素信號促進(jìn)S細胞的分化，晚期高水平的甲狀腺激素信號促進(jìn)L/M細胞的分化（圖4A）。

A-C:差異表達基因的熱圖A:改變表達階段B:持續表達階段C:無(wú)表達階段D:DIO3表達下調T3和T4的水平，導致S細胞分化E:DIO2表達將T4轉變?yōu)門(mén)3,啟動(dòng)Thrв信號，抑制S細胞，誘導L/M細胞

綜上所述,甲狀腺激素信號的動(dòng)態(tài)調節能調控人類(lèi)視網(wǎng)膜中視錐細胞的分化，這也為以后治療某些疾病奠定了理論基礎。

點(diǎn)評：

近年來(lái)有大量的研究工作關(guān)注干細胞（如iPSC）作為疾病模型和在潛在治療方式中的作用，尤其視網(wǎng)膜位于眼內，很難獲得活體的細胞或組織用于研究病理機制。目前已有多項iPSC向光感受器細胞、RPE、神經(jīng)節細胞系分化相關(guān)的研究，而且已經(jīng)可以在體外將iPSC培養轉化為和人視網(wǎng)膜相似的三維立體球形視網(wǎng)膜組織，記錄到光電反應波、檢測到視細胞標記物，甚至包含成熟的光感受器細胞。通過(guò)這些研究方法建立生理或病理模型，克服了難以獲取患者眼組織的難題，能夠有效的研究視網(wǎng)膜發(fā)育和疾病的關(guān)鍵調控機制，為將來(lái)的治療提供重要干預靶點(diǎn)。此技術(shù)無(wú)疑將成為研究視網(wǎng)膜變性疾病的最佳工具。