H5亞型禽流感(如H5N1)是一種全世界范圍的人畜共患病，嚴重威脅著(zhù)家禽產(chǎn)業(yè)以及人類(lèi)的公共健康。對禽流感病毒進(jìn)行及時(shí)、定量和亞型檢測，是快速診斷和疾病防控的重要基礎。等溫核酸擴增技術(shù)，尤其是環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，使核酸擴增可以在恒溫條件(60-65°C)下進(jìn)行，是對傳統PCR技術(shù)的重要改進(jìn)，尤其適用于條件欠發(fā)達地區以及現場(chǎng)快速檢測。數字等溫擴增技術(shù)，通過(guò)將反應體系分隔為大小均一的大量反應單元，進(jìn)行獨立的單拷貝等溫擴增，并基于泊松分布，對起始模板數量進(jìn)行精確統計，在準確性、靈敏度和絕對定量(不依賴(lài)于標準曲線(xiàn))方面有了革命性的改進(jìn)，尤其適用于病毒載量的定量檢測。因而，開(kāi)發(fā)適用于禽流感檢測的數字LAMP技術(shù)具有重要意義。

 

杜文斌課題組最近研發(fā)了一種界面打印液滴生成方法(Cross-interfaceEmulsification,XiE)(Xuetal.,2016,Anal.Chem.88:3171-3177)。其原理是利用穩定流速注射液體的毛細管在油-氣界面處的高頻振動(dòng)，利用在油-氣界面的表面張力的周期性切割作用，實(shí)現均一液滴的制備。通過(guò)該方法，可快速連續生成大量皮升至納升體積微液滴，平鋪于96孔板容器底部形成液滴陣列。XiE技術(shù)不依賴(lài)于微加工技術(shù)，成本低、操作自動(dòng)化程度高，非常適合于實(shí)現數字核酸擴增分析。前期的研究中，對基于XiE的數字等溫LAMP擴增進(jìn)行了初步研究，表明這一系統能夠實(shí)現準確的核酸定量檢測。在前期工作的基礎上，與中科院動(dòng)物研究所研究員何宏軒課題組合作，針對H5亞型的禽流感病毒的快速定量檢測，開(kāi)展了模型驗證和禽流感真實(shí)樣品的檢測。建立了特異性的H5亞型禽流感病毒LAMP檢測引物探針，首次驗證了數字LAMP用于H5禽流感病毒檢測的特異性、靈敏度和線(xiàn)性范圍。研究結果表明，數字LAMP與實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以及美國伯樂(lè )公司的QX200數字PCR系統的檢測靈敏度和線(xiàn)性一致，具有良好的特異性和準確性。值得指出的是，相比于數字PCR和熒光定量PCR，數字LAMP表現出更好的抗抑制劑能力(如腐植酸、SDS等)，可以保證方法對沒(méi)有充分除去污染物的野外或臨床樣品檢測的可靠性。

 

AbsoluteQuantificationofH5-subtypeAvianInfluenzavirusesUsingDropletDigitalLoop-mediatedIsothermalAmplification

 

ABSTRACT

 

HumaninfectionwithavianinfluenzaAH5N1virusescancauseseverediseaseswithhighmortalityrate,andcontinuestoposeasignificantthreattoglobalpublichealth.Rapiddiagnosisisneededforidentifyingthetypesofinfluenzavirusesformakingtimelytreatmentdecisions.Here,wedemonstrateabsolutequantificationofH5-subtypeinfluenzavirusesbydigitalloop-mediatedisothermalamplification(dLAMP)onourrecentlydevelopedcross-interfaceemulsification(XiE)method.OurresultsshowthatXiE-baseddLAMPishighlyspecificanddisplayscomparablesensitivitytoreal-timePCR(qPCR)anddigitalPCR(dPCR).Notably,dLAMPismoretoleranttoinhibitorysubstancesthanPCRmethods,anddemonstratesimilardetectionefficiencytoqPCRforrealH5N1samples.Therefore,itcanserveasarobustandprecisealternativetoqPCRordPCR,andisespeciallysuitableforenvironmentalandclinicalsampleswithhard-to-removecontaminants.WebelievethatourdLAMPmethodoffersgreatpotentialforrapidandaccuratediagnosisofinfluenzaandotherinfectiousdiseases.