真菌性腸炎

真菌性腸炎的檢查：

1.病原學(xué)檢查由于真菌廣泛分布于自然界，甚至空氣中也常有孢子飛揚，采集糞標本和檢查操作中，應盡可能減少污染，標本要新鮮。有些真菌傳染性很強如莢膜組織胞漿菌，應注意安全防護，以免造成實(shí)驗室人員感染。
(1)直接鏡檢標本：以10%氫氧化鉀或生理鹽水制片，高倍鏡下發(fā)現大量菌絲和孢子有診斷意義。對于雙相型真菌，僅查到孢子可能是正常帶菌。真菌性腸炎的6種常見(jiàn)病原多數情況下直接鏡檢即可鑒定，但孢子、菌絲和其他背景物質(zhì)有時(shí)相互混淆，不易辨認。
①菌絲和孢子：菌絲粗細一致，除毛霉菌外均有分隔，可見(jiàn)不同角度的分支，細胞質(zhì)均勻，內含大小不等的顆粒。孢子多為圓形或卵圓形，多數大小一致，邊緣整齊，可見(jiàn)細胞構造。
②細胞壁：在氫氧化鉀溶液處理的標本中，細胞壁常變寬，連接成弧狀，類(lèi)似菌絲，但無(wú)菌絲的構造。
③石棉體：比菌絲更細，不分節，無(wú)菌絲顆粒。
④植物纖維：未消化的食物殘渣，邊緣不整，無(wú)分支。
⑤脂細胞：圓形，構造模糊，無(wú)細胞壁。
⑥磷脂小球：大小不一，形狀不整，無(wú)細胞構造。
⑦氫氧化鉀結晶：雪花樣或珊瑚狀，邊緣呈鋸齒形，折光性強。
⑧小水皰：圓形，透亮，無(wú)細胞構造。
(2)染色鏡檢常用的染色方法：
①革蘭染色：適用于念珠菌，孢子、菌絲染成藍色，但著(zhù)色不均。
②過(guò)碘酸錫夫染色(PA5)：真菌孢子、菌絲均染成紅色。
③丫啶橙染色：熒光顯微鏡下真菌孢子呈亮綠色。
④吉姆薩染色和瑞特染色：適用于莢膜組織胞漿菌，染色前用甲醇固定，油鏡下菌體染成紅色，較小一端有出芽，菌體周?chē)幸蝗ηv膜樣結構，為此菌的細胞壁。通常菌體位于巨噬細胞或單核細胞內，少數位于細胞外。
⑤乳酸酚棉藍染色：適用于各種真菌培養涂片，菌體染成藍色。
(3)真菌培養：糞標本直接鏡檢通常不容易確定菌種，需參考糞培養結果，觀(guān)察菌落形態(tài)，再挑取菌落染色后鏡檢。常用沙保培養基和血瓊脂培養基。對于雙相型真菌還需在不同溫度下(25℃或37℃)分別培養，以便觀(guān)察其形態(tài)改變。
①大培養：是鑒別真菌的主要方法之一，可觀(guān)察菌落的生長(cháng)情況。根據菌落的生長(cháng)速度、形態(tài)、色澤等，初步判別菌種。
A.試管斜面：用白金環(huán)刺破瓊脂平面，分3點(diǎn)將標本接種于試管斜面培養基上。此法不易污染，但菌落較小。
B.培養皿：分3點(diǎn)將標本接種于平皿培養基中央，倒置后放恒溫箱中培養，每3天觀(guān)察1次菌落生長(cháng)情況。
②小培養：將大培養中生長(cháng)較好的菌落接種在玻片培養基上。培養1～3天后，在顯微鏡下觀(guān)察菌體的特征。
A.點(diǎn)片法：先將少許培養基成形于載玻片中央，再將菌種接種于培養基邊緣。覆以蓋玻片，置于有U形管的玻璃平皿中，培養后于不同時(shí)間取出鏡下觀(guān)察或染色鏡檢。
B.壓片法：將菌種接種在試管斜面或平皿培養基上，覆一蓋玻片，以便菌體向蓋玻片上生長(cháng)，然后于適當時(shí)間取出置于載玻片上鏡檢。
2.組織病理學(xué)檢查　有些真菌屬于人腸道內正常菌群，如白念珠菌。且真菌污染問(wèn)題廣泛存在，所以糞標本病原學(xué)檢查的診斷價(jià)值有限，有時(shí)需結合腸鏡活檢結果綜合判斷。
(1)曲菌感染的病理變化：具有診斷意義，包括：
①炎癥：急性滲出性炎癥。
②潰瘍形成：由于曲菌侵犯血管，引起血管破壞，出現血栓和組織壞死;潰瘍大小不一，形態(tài)各異，可深達肌層，底面粗糙不平，有膿性滲出。
③肉芽腫：由上皮細胞和巨噬細胞組成，伴有中性粒細胞、淋巴細胞或漿細胞浸潤。
④化膿性改變：黏膜下小膿腫形成，大量中性粒細胞浸潤，其中可見(jiàn)菌絲。
(2)病理切片中發(fā)現真菌孢子和菌絲，是侵襲性腸炎的直接證據，有肯定的診斷意義。染色方法包括：
①過(guò)碘酸錫夫染色：真菌呈紅色。
②烏洛托品銀染色：真菌呈黑色。
③丫啶橙熒光染色：真菌呈黃色或紅色熒光。
3.免疫學(xué)檢查
(1)真菌菌素皮膚試驗：用念珠菌、曲菌、組織胞漿菌、副球孢子菌等真菌的菌素或菌苗，按不同的稀釋比例做皮膚過(guò)敏試驗，48h后出現直徑大于5mm硬結或紅斑為陽(yáng)性，對于診斷臨床癥狀不典型的患者，有參考價(jià)值。
(2)血清抗原檢測：病原真菌被人體吞噬細胞等處理降解后，細胞壁和細胞漿抗原游離于血循環(huán)中，未被清除者可經(jīng)酶免疫法(EIA)、間接血凝試驗、免疫印跡法等檢測。加熱休克蛋白屬于真菌胞漿抗原。Walsh等對腫瘤并發(fā)侵襲型念珠菌病，于發(fā)病后24h內檢測有50%陽(yáng)性，特異性高達96%。又如用ElA法檢測曲菌腸炎患者血清中的細胞壁抗原和能與刀豆素A結合的相關(guān)抗原，有早期診斷價(jià)值，定量檢測抗原水平達100μg/ml時(shí)，可對真菌培養陰性者做出確診。
(3)血清抗體檢測：補體結合試驗對診斷組織胞漿菌腸炎有一定價(jià)值，可參考皮膚試驗結果綜合判斷以排除假陽(yáng)性。間接熒光素標記抗體定量試驗可用于診斷念珠菌腸炎。此外，尚有對流免疫電泳、乳膠凝集試驗、ELA等常用方法，以后者最為敏感。但對于艾滋病等伴有免疫功能抑制的患者，抗體檢測容易出現假陰性。
(4)猬集反應(cumping reaction)：念珠菌病患者血清內有一種猬集因子和抑制猬集現象的干擾物，前者可抑制由念珠菌在試管中的活力。血清猬集反應在正常人普遍存在，但感染念珠菌后，由于干擾物增多，猬集現象被抑制。
4.動(dòng)物接種試驗對于糞標本真菌培養的菌落，其致病性如何，可進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物接種加以鑒定。
(1)接種方法：刮取培養基上的菌落，研碎，加生理鹽水稍加震蕩，濾去菌絲，制成孢子混懸液，濃度為108/ml左右，注入動(dòng)物體內。根據動(dòng)物的大小及接種途徑，劑量0.2～1.0ml不等，可反復多次接種以加強對動(dòng)物的致病性。
(2)動(dòng)物的選擇與接種途徑：因菌種不同，對動(dòng)物的感染性也不同，應選擇適當的動(dòng)物和不同的接種途徑：
①白念珠菌：選用兔靜脈注射或小鼠腹腔注射。
②曲菌：選用兔、小雞靜脈或腹腔注射。
③毛霉菌：選用兔靜脈注射。
④組織胞漿菌：菌液加5%胃黏液素，選用大鼠或小鼠腹腔注射。
⑤副球孢子菌：選用豚鼠睪丸內注射。
⑥地絲菌：對動(dòng)物不致病。
(3)動(dòng)物解剖：解剖前將動(dòng)物放入5%苯酚溶液中消毒，然后在無(wú)菌條件下檢查相應組織、器官的病理改變，并取病灶材料作直接涂片和真菌培養。解剖后的動(dòng)物尸體應火化，不可土埋，以免致病真菌擴散。
利用氣相色譜法測定血清中真菌代謝產(chǎn)物或分解產(chǎn)物濃度，對診斷侵襲型真菌性腸炎有一定參考價(jià)值。如念珠菌胞壁上的甘露聚糖經(jīng)水解后產(chǎn)生甘露糖，其血清濃度在念珠菌菌血癥常大于800μg/ml，念珠菌腸炎在600～800μg/ml之間，正常人低于600 μg/ml。現代分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展也為深部真菌病的診斷開(kāi)辟了新的途徑。核配探針雜交和PCR技術(shù)，可測定真菌的特異性基因片段，敏感、快速，目前國內外均已開(kāi)展。如Buchman等報道，念珠菌羊毛固醇去甲基酶的編碼基因，為真菌特異性基因片段，通過(guò)PCR法檢測可用于臨床診斷深部真菌病。