手足口病（Hand-foot-mouthdisease,HFMD）是嬰幼兒人群常見(jiàn)的急性傳染病，主要表現為發(fā)熱和手、足和口等部位的皮疹或皰疹，可并發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦炎及急性弛緩性麻痹等中樞神經(jīng)系統癥狀，甚至死亡。多種腸道病毒感染可引起HFMD，腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A組16型（CA16）為引起世界范圍內HFMD爆發(fā)的主要病原體（1）。HFMD中約90%的死亡病例由EV71感染引起（2），EV71引起的HFMD已成為我國的重大公共衛生問(wèn)題之一。2015年，我國自主研發(fā)的EV71滅活疫苗獲批上市（3）。研究制定EV71疫苗質(zhì)量控制和評價(jià)技術(shù)技術(shù)要點(diǎn)，對規范并提高我國EV71疫苗的質(zhì)控標準和生產(chǎn)一致性，保證上市疫苗安全、有效和質(zhì)量可控具有重要意義。

 

本技術(shù)要點(diǎn)中EV71疫苗是指采用傳代細胞生產(chǎn)的全病毒滅活疫苗，或采用重組DNA技術(shù)將具有免疫保護性的抗原基因克隆到表達載體上，轉化相應的宿主中表達的EV71抗原蛋白，經(jīng)過(guò)純化等工藝制備的EV71疫苗。

 

本技術(shù)要點(diǎn)中凡涉及生物制品質(zhì)量控制的通用要求，均應按現行版《中華人民共和國藥典》三部有關(guān)規定執行（4）；有關(guān)生產(chǎn)設施的要求應參照國家食品藥品監督管理總局（CFDA）2010版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規范》執行（5）。

 

本技術(shù)要點(diǎn)僅為對EV71疫苗進(jìn)行質(zhì)控和評價(jià)技術(shù)要求的指導性文件，需根據技術(shù)的發(fā)展和實(shí)際需要進(jìn)行適當的更新。

 

 

EV71屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，為無(wú)包膜病毒。EV71顆粒為20面體的對稱(chēng)結構，直徑約24-30納米，由60個(gè)亞單位組成。病毒基因組為單股正鏈RNA，7400核苷酸左右，包含有5’-UTR區和3’-PolyA尾。

 

EV71的衣殼蛋白主要由VP1、VP2、VP3和VP4組成，其中，VP1、VP2和VP3位于病毒衣殼外部，VP4位于病毒衣殼內部。VP1是EV71主要的抗原表位。EV71只有一個(gè)血清型，依據VP1區序列可分為A、B和C3個(gè)基因型以及11個(gè)基因亞型。我國臺灣、香港以及其他國家或地區近年來(lái)流行的主要基因型包括B4、B5、C2、C4和C5等亞型（6），我國大陸流行的EV71主要為C4亞型。5歲以下兒童和嬰幼兒為EV71易感人群（7）。在后脊髓灰質(zhì)炎時(shí)代，EV71已成為對人類(lèi)健康危害最大的腸道病毒（8）。

 

多個(gè)國家或地區的企業(yè)和研究機構開(kāi)展了EV71疫苗的研發(fā)，疫苗種類(lèi)包括全病毒滅活疫苗、基因工程重組蛋白疫苗、減毒活疫苗和多肽疫苗等（9）。其中，我國3家企業(yè)研發(fā)的EV71全病毒滅活疫苗對EV71感染所致HFMD的保護效果分別為97.4%，94.7%和90.0%（10-12）。2015年12月，CFDA批準中國醫學(xué)科學(xué)院醫學(xué)生物學(xué)研究所和北京科興生物制品有限公司生產(chǎn)的EV71全病毒滅活疫苗上市（3），為我國及世界范圍控制EV71感染相關(guān)的疾病，特別是嚴重HFMD的爆發(fā)和流行提供了手段。

 

近年來(lái)HFMD流行病原譜發(fā)生改變，柯薩奇病毒A組6型、A組10型病毒感染引起HFMD的流行呈增長(cháng)趨勢，提出了研發(fā)防控HMFD多價(jià)疫苗的需（13,14）。基因工程重組蛋白疫苗中的病毒樣顆粒（VLP）疫苗具有易工業(yè)化規模生產(chǎn)的優(yōu)勢，且在動(dòng)物試驗上顯示良好的保護效果，顯示了研發(fā)EV71VLP疫苗的可行性（15,16）。

 

本技術(shù)要點(diǎn)重點(diǎn)關(guān)注EV71疫苗生產(chǎn)的質(zhì)控和評價(jià)，強調生產(chǎn)過(guò)程的一致性，同時(shí)對研發(fā)階段的疫苗也提出相關(guān)標準和要求，以保證研發(fā)和生產(chǎn)階段中疫苗質(zhì)控和評價(jià)方法及標準的銜接。

 

 

應依據世界衛生組織（WHO）相關(guān)文件以及CFDA《預防用疫苗臨床前研究技術(shù)技術(shù)要點(diǎn)》等技術(shù)文件進(jìn)行EV71疫苗臨床前質(zhì)控和評價(jià)研究（17-19）。新研發(fā)疫苗的質(zhì)量標準整體上應達到或高于上市疫苗的標準，動(dòng)物保護試驗中疫苗免疫誘導的中和抗體水平和保護效果應與上市疫苗具有可比性。

 

 

疫苗生產(chǎn)用毒株的篩選和確定是滅活疫苗研發(fā)成功的關(guān)鍵。應選擇主要流行基因型的毒株（目前我國為C4型）作為疫苗候選株進(jìn)行篩選，重點(diǎn)關(guān)注不同毒株的交叉保護能力和遺傳穩定性。采用目前世界范圍流行的毒株（B4、B5、C2、C4和C5等）及國內不同地區的流行毒株，和/或構建不同基因亞型的假病毒進(jìn)行保護能力比較，選擇中和能力強且中和范圍廣的2~3個(gè)毒株作為EV71候選疫苗株。挑選主要免疫原性區域（VP1）核苷酸序列一致的毒株進(jìn)行克隆純化，并規定代次，建立主種子批和工作種子批。進(jìn)行擴大培養、發(fā)酵、收獲、純化及滅活工藝等適應性研究，選擇工藝適應性和免疫原性較好的候選疫苗株作為疫苗生產(chǎn)株。檢定項目應包括鑒別試驗、病毒滴定、免疫原性、無(wú)菌檢查、外源因子和遺傳穩定性等項，各級種子批VP1區核苷酸序列不應發(fā)生改變，同時(shí)具有相近的病毒滴度和免疫原性。應依據現行版《中國藥典》中的要求，建立符合規定的細胞庫用于生產(chǎn)。

 

 

應選擇EV71保護性抗原的基因序列作為目的基因，構建基因工程重組蛋白疫苗的工程菌毒株（即生產(chǎn)用菌毒株）。目前，已報道應用于研發(fā)EV71疫苗的表達系統包括釀酒酵母、漢遜酵母、畢赤酵母以及昆蟲(chóng)細胞桿狀病毒等。構建過(guò)程中應篩選目的基因完全正確，表達量高且遺傳穩定性好的克隆作為疫苗生產(chǎn)用菌毒株，建立三級種子系統。應規定主種子批和工作種子批的代次，進(jìn)行鑒別試驗、無(wú)菌檢查、遺傳穩定性、抗原表達水平和免疫原性等項檢定。其中，漢遜酵母等表達體系應測定整合拷貝數；釀酒酵母表達系統需測定質(zhì)粒保有率；表達產(chǎn)物應鑒別為目的蛋白，建立表達量測定方法和標準。對昆蟲(chóng)細胞，除應符合常規傳代細胞系的要求外，還應考慮對昆蟲(chóng)細胞敏感的和可能引入的特殊污染病毒或外源因子（如螺原體），建立檢測方法和質(zhì)控指標。重組蛋白疫苗誘導的中和抗體與主要流行毒株和/或假毒株的中和交叉能力與滅活疫苗應具有可比性。

 

有研究提出EV71全病毒滅活疫苗免疫誘導的中和抗體水平可作為人體免疫保護的替代指標（10,11）。應探討疫苗免疫不同品系動(dòng)物后誘導的中和抗體應答，確定適宜的動(dòng)物模型，開(kāi)展疫苗免疫原性驗證研究，獲得疫苗誘導的中和抗體應答數據，包括1劑免疫后不同時(shí)間的抗體轉歸，2、3劑加強后的抗體應答和轉歸，以及疫苗的劑量效應關(guān)系。中和抗體測定常采用經(jīng)典的細胞病變法（CPE）或其他經(jīng)驗證的方法，假病毒方法可在經(jīng)過(guò)驗證及相關(guān)性分析后采用（20）。中和抗體水平可采用效價(jià)（Titer）表示，推薦采用國家標準品單位（U）或WHO單位（IU）作為中和抗體水平單位進(jìn)行標化。免疫原性和保護效果評價(jià)可選擇乳鼠、小鼠及獼猴等作為模型動(dòng)物。攻毒和免疫方式包括免疫母體后的母傳抗體攻毒保護法、抗體被動(dòng)保護攻毒實(shí)驗動(dòng)物法等。應在先確定攻毒株的半數致死劑量（LD50）的基礎上，研究獲得疫苗動(dòng)物保護的半數有效劑量（ED50）。可選用上市疫苗作為對照，也可比對報道的疫苗乳鼠保護ED50，綜合評定疫苗保護效果（21）。在進(jìn)行評價(jià)時(shí)應考慮方法的標準化和規范化，如標準毒株、標準物質(zhì)以及標準化的動(dòng)物模型等。

 

應依據現行版《中國藥典》三部中人用疫苗總論、基因重組產(chǎn)品總論以及相關(guān)技術(shù)要點(diǎn)等要求，結合自身生產(chǎn)工藝特點(diǎn)等，進(jìn)行EV71疫苗質(zhì)量特性研究。內容應包括理化結構確證、雜質(zhì)及純度分析、生物活性研究等。在進(jìn)行全面質(zhì)量特性研究的基礎上建立疫苗的質(zhì)量標準。

 

EV71的中和表位主要包括3個(gè)區域，位于病毒的5次對稱(chēng)軸附近：VP1的G-H環(huán)、H-I環(huán)和VP2的E-F環(huán)等（22）。對滅活疫苗，需重點(diǎn)關(guān)注與已上市疫苗結構和活性的一致性，包括疫苗中實(shí)心（F）和空心（E）顆粒的比例、比活、誘導中和抗體能力以及動(dòng)物保護效果等指標；對于基因重組VLP疫苗，應對VLP蛋白結構進(jìn)行鑒別和分析，包括SDS-PAGE或N-末端測序等方法進(jìn)行VLP分子量和構成測定，采用特異的多抗或單克隆抗體鑒別VP1等抗原基因表達的目標蛋白，氨基酸序列分析、肽圖等方法鑒別VLP的一級結構；采用原子力和透射電子顯微鏡，以及動(dòng)態(tài)光散射等方法測定EV71VLP的聚集性；應用結構生物學(xué)或免疫學(xué)手段分析VLP保護性結構位點(diǎn)，研究不同條件下抗原結構改變引起免疫原性的降低等。應分析VLP疫苗與滅活疫苗中E顆粒結構以及免疫原性的相似性，探討保護位點(diǎn)與滅活疫苗抗原的差異，比對相同蛋白含量或相同活性單位時(shí)免疫原性包括交叉保護能力的差異。

 

滅活疫苗標準應不低于已上市疫苗，如主種子批和工作種子批VP1區核苷酸序列應與原始種子一致，EV71抗原顆粒特異性峰按面積歸一化法計算純度（高效液相色譜法，HPLC）應在95.0%以上，Vero細胞宿主蛋白和殘余DNA每劑不超過(guò)設定的標準等。EV71疫苗原液的F、E顆粒與疫苗免疫原性有關(guān)，Ｆ顆粒具有更好的免疫原性（23），研發(fā)滅活疫苗時(shí)建議考慮建立相應的檢測方法，制定F及E顆粒比例的質(zhì)控標準。在工藝相關(guān)雜質(zhì)控制方面，當應用DNA酶去除殘留宿主細胞DNA時(shí)，除應關(guān)注殘留DNA酶的質(zhì)控外，應考慮小片段DNA的生物學(xué)效應及對免疫的影響，必要時(shí)應研究相應的檢測方法和標準（24）。

 

應考慮建立VLP疫苗菌株或細胞表達目的蛋白的鑒別、表達量和遺傳穩定性質(zhì)控標準。結構鑒別是VLP疫苗質(zhì)控的重點(diǎn)，需在系統鑒別VLP抗原的基礎上，選擇確定科學(xué)、可行的結構鑒別方法和標準，如定期N-末端測序方法等。建立并驗證檢測殘留菌株細胞蛋白、核酸成分、添加的有機溶劑、疫苗純度以及效力等指標的方法，并初步制定相應的標準。應探討國家EV71疫苗抗原含量和效力測定標準品是否適宜于所研發(fā)的制品，必要時(shí)應建立相應的參考品或對照品。此外，應參考已上市的重組類(lèi)疫苗及重組類(lèi)治療用生物制品的相關(guān)要求進(jìn)行質(zhì)量控制。

 

疫苗研發(fā)時(shí)應關(guān)注過(guò)程控制，在完成工藝優(yōu)化和驗證后，可將EV71疫苗抗原含量或比活作為一致性監測的主要指標，收集不同批次檢測數據，擬定疫苗生產(chǎn)中關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)的抗原含量或比活的一致性可接受范圍。

 

 

疫苗質(zhì)量評價(jià)與標準物質(zhì)密不可分，只有采用統一的標示方式，不同國家或地區的疫苗管理、研發(fā)、生產(chǎn)及使用者在比較疫苗的關(guān)鍵質(zhì)量指標，如活性或效力時(shí)才能具有可比性。因此，在疫苗研發(fā)階段即應重視建立及應用疫苗標準物質(zhì)，以保證質(zhì)量的一致性和檢測結果的準確性。用于評價(jià)與臨床免疫保護效果相關(guān)的疫苗關(guān)鍵質(zhì)量屬性，如活性或效力測定時(shí)所用標準物質(zhì)，原則上應來(lái)自可溯源至臨床試驗時(shí)具有確切保護效果的原料批次。企業(yè)應采用已建立國家的EV71疫苗抗原標準品、中和抗體標準品、效力標準品進(jìn)行疫苗的質(zhì)控和評價(jià)。在完成工藝優(yōu)化后，可考慮制備一批EV71疫苗抗原作為疫苗工作對照品，用于對其后研制批次疫苗的質(zhì)量比對。對企業(yè)自建的檢測方法，應考慮建立相應的工作參考品或對照品。

 

目前上市的EV71疫苗為純化、滅活的EV71全病毒抗原，經(jīng)氫氧化鋁佐劑吸附制備而成的疫苗。批準生產(chǎn)的細胞基質(zhì)分別為人二倍體細胞及Vero細胞。疫苗生產(chǎn)實(shí)施全過(guò)程質(zhì)量控制，要求對EV71疫苗生產(chǎn)過(guò)程的每一工藝環(huán)節，以及使用的每一種原輔材料進(jìn)行質(zhì)控，并對關(guān)鍵步驟及其工藝參數建立控制范圍，建立關(guān)鍵中間產(chǎn)物質(zhì)控指標。依據WHO和我國對疫苗批簽發(fā)的相關(guān)要求，對EV71疫苗活性成分和雜質(zhì)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性定量檢測數據，以及疫苗質(zhì)控和檢測所使用的標準品、工作參考品及對照品均進(jìn)行趨勢分析，以最大程度保證生產(chǎn)疫苗的批間一致性。在EV71疫苗成品效力檢定方面，設定了體內效力和體外相對效力雙質(zhì)控標準，為將來(lái)用體外相對效力替代體內效力提供基礎。

 

目前已建立的國家疫苗標準物質(zhì)包括：EV71血清中和抗體國家標準品、EV71疫苗抗原國家標準品和EV71疫苗效力測定國家參考品。第一代EV71血清中和抗體國家標準品（2010國生標字0024），為健康人血清經(jīng)凍干分裝制備而成，包括強陽(yáng)性（1000U）、弱陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品組成，用于疫苗誘導中和抗體測定的質(zhì)控。EV71疫苗抗原國家標準品（2010國生標字0023），為應用Vero細胞基質(zhì)制備的EV71全病毒抗原（1600U/ml），用于疫苗抗原活性測定的質(zhì)控（25）。EV71疫苗效力測定國家參考品（2016國生參字0074），為應用Vero細胞基質(zhì)制備的EV71全病毒滅活疫苗，經(jīng)III期疫苗臨床試驗獲得臨床保護效果的數據，同時(shí)具有較好的穩定性，用于疫苗成品效力檢定的質(zhì)控（26）。

 

2015年，WHO生物制品標準化專(zhuān)家委員會(huì )批準第一代EV71血清中和抗體國際標準品（1stISforanti-EV71serum(Human)，批號：14/140），該標準品為健康人血清經(jīng)凍干分裝制備而成，每支含1000IU，用于EV71疫苗誘導中和抗體測定的質(zhì)控；以及低效價(jià)EV71國際參考品（批號：13/238），300IU/支，作為實(shí)驗質(zhì)控品（27）。目前EV71疫苗抗原國際標準品正在研制中。建議疫苗生產(chǎn)企業(yè)依據國家標準品建立用于產(chǎn)品放行質(zhì)控的參考品或對照品，應注意標準物質(zhì)標定的可溯源性。

 

 

EV71疫苗生產(chǎn)中應用的種子批、細胞基質(zhì)，培養基/培養液等原材料的質(zhì)控標準應符合現行版《中國藥典》的相關(guān)要求。應使用批準的工作種子批代次生產(chǎn)疫苗。主種子批和工作種子批應測定病毒滴度，疫苗株的主要保護蛋白VP1區核苷酸序列在不同種子批之間應不發(fā)生改變，以保證遺傳穩定性，免疫原性檢測標準為應用１針程序免疫小鼠，中和抗體陽(yáng)轉率應大于80%。應進(jìn)行無(wú)菌檢查、支原體檢查和外源因子檢查，保證無(wú)細菌、真菌、支原體及外源因子污染。

 

只有經(jīng)批準的細胞基質(zhì)才能用于EV71疫苗生產(chǎn)，疫苗生產(chǎn)中應用的細胞基質(zhì)包括已批準的二倍體和Vero細胞。WHO建議疫苗生產(chǎn)企業(yè)盡可能采用150代作為Vero細胞的限定代次（28）。主細胞庫至少需進(jìn)行反轉錄病毒實(shí)驗、牛源或豬源病毒檢查、致瘤性試驗、無(wú)菌檢查、支原體檢查和外源因子檢查等，同時(shí)應對細胞培養用牛血清的來(lái)源進(jìn)行限定。

 

取EV71疫苗工作種子批毒種，按規定的MOI接種細胞基質(zhì)，依據批準的溫度、時(shí)間培養病毒并收獲。單個(gè)收獲物的儲存應在批準的條件和時(shí)限內。同一細胞批生產(chǎn)的病毒液合并為病毒收獲液。病毒收獲液應按照連續生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)入后續的純化處理工藝。樣品收獲后應立刻進(jìn)行抽樣檢定。

 

 

收獲物的關(guān)鍵檢定項目包含病毒滴定、抗原含量和蛋白含量測定，以及無(wú)菌檢查和支原體檢查等項，應分別符合批準的標準。生產(chǎn)企業(yè)應提供收獲次數中單個(gè)生產(chǎn)收獲物，以及合并收獲物的各自一致性檢測數據，并應符合已批準的體現質(zhì)量一致性的標準。

 

應采用批準的工藝進(jìn)行EV71疫苗抗原的純化，如色譜柱層析等。純化的病毒液可進(jìn)行合并和適當濃縮。純化病毒液經(jīng)濾膜過(guò)濾即為疫苗原液。當EV71疫苗原液因等待檢測結果需暫存時(shí)，應依據前期穩定性研究的結果，按批準的保存方式和時(shí)間保存。

 

 

應采用批準的經(jīng)驗證的滅活劑和工藝進(jìn)行EV71病毒的滅活，在限定總蛋白含量下，采用一定濃度的滅活劑，在確定的最佳溫度下滅活足夠時(shí)間，保證EV71病毒得到充分滅活。對每個(gè)病毒滅活容器均取樣進(jìn)行病毒滅活驗證試驗，按規定量，將EV71滅活液接種適宜細胞基質(zhì)，35～37℃培養5～7天，凍融后同法再盲傳２代，顯微鏡觀(guān)察每代次應均無(wú)CPE。

 

應采用批準的EV71鑒別實(shí)驗、抗原含量等檢測方法對原液和中間產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)控。抗原含量的檢測多采用ELISA方法，需應用國家抗原標準品進(jìn)行質(zhì)控和含量賦值（U），也可自建對照品以監測測定結果的準確性。由于EV71疫苗為鋁佐劑吸附疫苗，在成品中受佐劑以及蛋白稀釋等因素影響的檢定項目需在原液階段進(jìn)行。疫苗相關(guān)工藝雜質(zhì)如牛血清白蛋白殘留量、Vero細胞蛋白殘留量和DNA殘留量，殘留添加物如有機溶劑聚乙二醇6000、聚山梨酯80或Triton-X100等，以及非限制性核酸內切酶限度檢定均應符合批準的限度。疫苗抗原純度檢測時(shí)原液中目標蛋白的純度應不低于95.0%。應采用適宜的方法測定原液中可能潛在雜質(zhì)蛋白的含量或比例，如SDS-PAGE或HPLC方法等。應關(guān)注抗原降解產(chǎn)物的鑒別和檢測，考慮制定可接受的范圍。病毒滅活驗證試驗時(shí)，將細胞盲傳3代，應不得出現細胞病變。應證明無(wú)細菌、真菌、分枝桿菌和支原體污染。

 

 

依據每批疫苗按抗原定量配制的要求，基于原液中EV71抗原的測定含量，以及成品疫苗的目標劑量，加入稀釋液及氫氧化鋁吸附劑，配制成目標劑量的半成品。由于EV71疫苗為鋁佐劑吸附產(chǎn)品，半成品檢定時(shí)除檢測無(wú)菌、pH和氫氧化鋁外，應測定EV71抗原吸附率。

 

依據企業(yè)注冊標準和現行版《中國藥典》進(jìn)行分裝、包裝和檢定。自建的方法需經(jīng)批準，應用藥典的方法需經(jīng)過(guò)驗證。疫苗成品質(zhì)控項目包括EV71疫苗鑒別實(shí)驗、外觀(guān)、裝量、無(wú)菌檢查、細菌內毒素檢查和異常毒性等指標；理化項目包括pH，氫氧化鋁含量，游離甲醛含量以及滲透壓摩爾濃度等指標。細胞培養液中添加抗生素時(shí)，需檢測成品中抗生素殘留量。疫苗的效力測定包括體內效力（ED50）以及體外相對效力，并測定中和抗體應答。疫苗抗原含量和中和抗體水平測定時(shí)需應用國家抗原和中和抗體標準品進(jìn)行質(zhì)控和賦值。抗原含量或效力測定標準的確定應綜合考慮檢測方法的誤差，半成品配制操作過(guò)程中可能存在的偏差，以及成品在有效期內可接受的抗原降解。

 

 

EV71疫苗為鋁佐劑吸附疫苗，具有較好的穩定性。疫苗穩定性評價(jià)應依據WHO相關(guān)文件和現行版《中國藥典》中人用疫苗總論等要求進(jìn)行（4,29）。穩定性評價(jià)的類(lèi)型包括實(shí)時(shí)條件下、加速穩定性、極端條件下及熱穩定性研究，其中實(shí)時(shí)條件下穩定性研究為最基本的研究，疫苗獲批后生產(chǎn)階段一般選擇在實(shí)時(shí)條件下的穩定性研究。按照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規范》（2010年修訂）中持續穩定性考察要求進(jìn)行。通常情況下至少每年應當考察一個(gè)批次。中間產(chǎn)物穩定性評價(jià)目的為確定中間產(chǎn)物儲存的條件和時(shí)間。成品穩定性評價(jià)則是確定疫苗的保持條件和有效期，并保證有效期內疫苗的有效性和安全性。EV71疫苗中間產(chǎn)物和疫苗成品的儲存條件和時(shí)間應依據批準的標準執行。EV71疫苗為鋁佐劑吸附疫苗，嚴禁凍結，因鋁佐劑疫苗遭凍結后將永久性破壞免疫原性。

 

 

疫苗批簽發(fā)，是指國家食品藥品監管部門(mén)對預防性疫苗在每批制品出廠(chǎng)上市前或者進(jìn)口時(shí)，由指定的藥品檢驗機構進(jìn)行審核、檢驗及簽發(fā)的制度（30）。我國疫苗批簽發(fā)主要采用資料審核和樣品檢驗相結合的形式。在批簽發(fā)過(guò)程中，應特別重視對關(guān)鍵質(zhì)量參數的趨勢分析。應用趨勢分析可發(fā)現某些批次疫苗出現偏差，啟動(dòng)調查并采取措施；考察生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生的變更對制品的影響（如工作種子批、設備）以及在一定生產(chǎn)周期內疫苗質(zhì)量的變化趨勢。因此疫苗批簽發(fā)是確定疫苗生產(chǎn)一致性，保證上市疫苗有效性、安全性的必要手段。

 

 

企業(yè)應向批簽發(fā)藥檢機構提供每批EV71疫苗的批制造及檢定記錄摘要。批制造及檢定記錄摘要應涵蓋生產(chǎn)、檢定過(guò)程中各環(huán)節的主要參數、經(jīng)批準的企業(yè)名稱(chēng)、地址，及所生產(chǎn)疫苗的品種、批量和批號等，所提供的信息應確定、并可追溯。注明成品中起始材料、中間產(chǎn)物及半成品各個(gè)組分的失效日期；以生產(chǎn)流程圖的方式，確認疫苗起始材料、中間產(chǎn)物、半成品和成品的唯一、合理的生產(chǎn)流程，生產(chǎn)流程應能追溯主要組分生產(chǎn)全過(guò)程；疫苗生產(chǎn)用毒株、二倍體細胞或Vero細胞基質(zhì)的名稱(chēng)和代次應與批準的一致；證實(shí)疫苗生產(chǎn)工藝及規模、質(zhì)控檢測方法、質(zhì)量標準，中間產(chǎn)物的批號、批量、保存條件等數據與批準的相同。關(guān)鍵工藝步驟操作參數、關(guān)鍵中間產(chǎn)物檢測結果、目的產(chǎn)物收率應在可接受范圍內；依據所提供的相關(guān)信息確認疫苗中活性組分含量等的理論值和實(shí)際值；提供疫苗起始材料、中間產(chǎn)物、半成品和成品的檢測結果和質(zhì)量標準，包括每項檢定的結果；應提供檢測的起始日期、方法、關(guān)鍵試劑，標準物質(zhì)、工作參考品和對照品的列表以及相關(guān)的制備、標定和穩定性等關(guān)鍵信息。

 

 

對EV71疫苗關(guān)鍵中間產(chǎn)物及成品活性成分和雜質(zhì)的定量檢測數據，均應進(jìn)行趨勢分析，如收獲液病毒滴度，原液抗原含量、蛋白含量、純度，成品體外相對效力、體內效力、理化指標以及可定量檢測的雜質(zhì)等項目；對于疫苗質(zhì)控和檢測中所使用的標準物質(zhì)、工作參考品及對照品也應進(jìn)行趨勢分析。

 

生產(chǎn)企業(yè)應對EV71疫苗檢驗的所有關(guān)鍵性定量數據繪制趨勢分析圖。當疫苗檢測批次結果的數量少于40個(gè)，應在至少6個(gè)連續批檢驗結果的基礎上計算平均值和SD值，每個(gè)新的結果可添加并重新計算平均值和SD值。當批次結果數量等于或多于40個(gè)時(shí)，應根據至少10批不同原液得到最初的40個(gè)結果確定平均值和SD值。在其后持續進(jìn)行趨勢分析中不再隨新增檢驗結果重新計算平均值，避免因引入新的檢測數據而發(fā)生偏移。

 

生產(chǎn)企業(yè)應確定疫苗質(zhì)控關(guān)鍵項目趨勢分析的警戒限和行動(dòng)限。當出現1批疫苗檢驗結果超出行動(dòng)限，3個(gè)連續批疫苗超出警戒限，或趨勢有嚴重漂移，以及連續3至5批疫苗在均值一側且接近警戒限時(shí)，應啟動(dòng)調查，查找分析原因，評估對疫苗質(zhì)量的影響風(fēng)險，確定相關(guān)批次疫苗是否予以放行，批簽發(fā)機構依據同樣的原則決定是否予以簽發(fā)。

 

應開(kāi)展標準物質(zhì)和對照品的趨勢分析，目的是為監測EV71疫苗標準物質(zhì)的活性，以進(jìn)行檢定實(shí)驗室的質(zhì)控。包括對應用國家標準物質(zhì)的測定值，以及對企業(yè)用于疫苗質(zhì)控和檢測所自建工作參考品、對照品測定值的趨勢分析等，應繪制趨勢分析圖，規定相應的警戒限和行動(dòng)限。

 

應定期完成疫苗趨勢分析和報告。EV71疫苗生產(chǎn)企業(yè)和批簽發(fā)機構分別每半年或一年將各自檢測關(guān)鍵項目的數據與前期數據進(jìn)行比較。需比較批簽發(fā)機構與生產(chǎn)企業(yè)的數據，結果分析時(shí)應考慮兩者檢定時(shí)的時(shí)間差異。

 

 

起草單位：中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所肝炎病毒疫苗室

 

致謝：提出修改意見(jiàn)的各位專(zhuān)家及3家EV71疫苗生產(chǎn)企業(yè)

 

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