中國科學(xué)院武漢病毒研究所龔鵬研究員課題組長(cháng)期從事以聚合酶為核心的RNA病毒復制關(guān)鍵酶類(lèi)的催化與調控機制研究，2013年10月起與武漢大學(xué)潘茲書(shū)教授課題組建立合作關(guān)系，共同研究黃病毒科瘟病毒屬代表種豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）的NS5B聚合酶與NS3蛋白酶-解旋酶的功能機制。2015年和2017年，豬瘟病毒NS3解旋酶和全長(cháng)晶體結構先后報道，但結構中并未發(fā)現蛋白酶與解旋酶形成的分子內關(guān)鍵相互作用。近期，該合作團隊解析了一種新的“關(guān)閉式”構象的NS3全長(cháng)晶體結構（PDB號：5WX1），結構中蛋白酶與解旋酶形成了由三個(gè)相互作用簇構成的面積達2200平方埃的分子內作用界面，首次發(fā)現了瘟病毒NS3可采取一種和蛋白酶順式切割相關(guān)的構象（圖中上方構象），明確與反式切割（圖中下方構象）不兼容。團隊對此關(guān)閉式構象的生物學(xué)相關(guān)性進(jìn)行了體外酶學(xué)驗證，發(fā)現這一構象具有最優(yōu)的解旋酶活性，通過(guò)點(diǎn)突變擾動(dòng)該構象可導致解旋酶活性大幅降低。進(jìn)一步通過(guò)在全長(cháng)病毒水平的測試發(fā)現對上述三個(gè)相互作用簇的擾動(dòng)均可不同程度地影響病毒滴度和病毒噬斑形成及尺寸，驗證了晶體結構所揭示的關(guān)閉式構象對病毒復制的重要性。

 

豬瘟病毒NS3蛋白酶-解旋酶協(xié)同作用模式圖。上方的關(guān)閉式構象為本項研究解析的晶體結構所揭示，模擬蛋白酶（Pro）順式切割NS3-NS4A連接點(diǎn)后的狀態(tài)，具有最優(yōu)的解旋酶（Hel）活性。該構象需轉換為開(kāi)放式構象（下方）后方可實(shí)現反式切割，但解旋酶活性隨之降低。

 

黃病毒科NS3不僅自身具有功能多樣性，還直接參與調控病毒聚合酶的功能，團隊的研究成果不僅為全面闡釋NS3的功能提供了重要依據，也為進(jìn)一步研究NS3與NS5B聚合酶的分子間調控機制奠定了基礎。此項合作研究受到科技部973項目“重要病毒轉錄復制蛋白復合體的結構功能研究”（2013CB911100）和數項國家自然科學(xué)基金面上項目（31272585、31570152、31670154）的支持。潘茲書(shū)課題組的博士研究生鄭峰偉和龔鵬課題組的助理研究員逯國亮為論文的并列第一作者。

 

ABSTRACT

 

ThenonstructuralproteinNS3fromtheFlaviviridaefamilyisamulti-functionalproteinthatcontainsanN-terminalproteaseandaC-terminalhelicase,playingessentialrolesinviralpolyproteinprocessingandgenomereplication.Herewereportafull-lengthcrystalstructureoftheClassicalswinefevervirus(CSFV)NS3incomplexwithitsNS4Aproteasecofactorsegment(PCS)at2.35?resolution.Thestructurerevealsapreviouslyunidentified～2200-?2intra-molecularprotease-helicaseinterfacecomprisingthreeclustersofinteractions,representinga“closed”globalconformationrelatedtotheNS3-NS4Acis-cleavageevent.Althoughthisconformationisincompatiblewithproteasetrans-cleavage,itappearstobefunctionallyimportantandbeneficialtothehelicaseactivity,asthemutationsdesignedtoperturbthisconformationimpairedboththehelicaseactivitiesinvitroandvirusproductioninvivo.Collectively,ourworkrevealsimportantfeaturesofprotease-helicasecoordinationinpestivirusNS3,andprovidesakeybasisforhowdifferentconformationalstatesmayexplicitlycontributetocertainfunctionsofthisnaturalprotease-helicasefusionprotein.

 

IMPORTANCE

 

ManyRNAvirusesencodehelicasestoaidtheirRNAgenomereplicationandtranscriptionbyunwindingstructuredRNA.Beingnaturallyfusedtoaproteaseparticipatinginviralpolyproteinprocessing,theNS3helicasesencodedbytheFlaviviridaefamilyvirusesarequiteunique.Therefore,howthesetwoenzymemodulescoordinateinasinglepolypeptideisofparticularinterest.HerewereportapreviouslyunidentifiedconformationofpestivirusNS3incomplexwithitsNS4Aproteasecofactorsegment(PCS).Thisconformationalstateisrelatedtotheproteasecis-cleavageeventandisoptimalforthefunctionofhelicase.ThisworkprovidesanimportantbasistounderstandhowdifferentenzymaticactivitiesofNS3maybeachievedbythecoordinationbetweentheproteaseandhelicasethroughdifferentconformationalstates.